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《浙江大学》 2002年
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Sim vastatin抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖诱导凋亡及其相关信号转导机制

程刚  
【摘要】: 在真核多细胞生物中,细胞数目控制是通过细胞分裂、增殖、细胞主动死亡之间的动态平衡实现的,这种平衡对生物体的发育和正常结构与功能的保持有重要意义。细胞凋亡同细胞增殖一样是普遍存在的一种生物现象,是贯穿于机体整个生命活动过程的基本生理机制,它调节着机体细胞增殖与更新间的平衡,维持组织器官正常生理功能及细胞数量的稳定,如果增殖与凋亡的平衡失调则会产生很多疾病。以往的研究早已表明血管平滑肌细胞(VSMC)异常增殖与冠状动脉球囊扩张(PTCA)后再狭窄密切相关,近年来研究发现凋亡在PTCA术后再狭窄中亦起了重要的作用,虽然VSMC凋亡在再狭窄发生、发展中的作用还有争议,但多数学者普遍认为在PTCA术后早期往往存在着VSMC增殖过度凋亡不足的情况,增殖与凋亡平衡失调在再狭窄发生早期起了重要作用,如果能够有效的抑制PTCA术后早期VSMC异常增殖、诱导其凋亡将有助于治疗再狭窄的发生。最近研究表明3羟3甲戊二酰辅酶A(HMG-COA)还原酶抑制剂除传统的降血脂的作用外,还能抑制血管平滑肌细胞增殖、诱导凋亡,但其具体机制仍不清楚。VSMC的增殖与凋亡均受细胞内一系列相关基因表达产物的调控,并存在着复杂的信号转导机制,本实验以培养的正常SD大鼠主动脉平滑肌细胞为研究对象, 一 观察3羟3甲戊=$辅酶A(HMGed0A)还原酶抑制剂辛伐他汀(sisvastatin)抑制 ySMC增殖、诱导凋亡及对相关基因的表达调控和它们之间的信号转导机制。 第一邵分 辛伐他汀抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖及相应信号转导 机制 研究目的:观察simvastatin对VSMC增殖的抑制作用及其对细胞周期和周期蛋白依 赖性激酶抑制物PZI、P27及细胞G;-S期转换重要调节基因PTEN、CrpyC表达的影 响,并进一步观察PTEN和p27是否存在上下游关系及simvastatin是否通过抑制3 羟3甲戊二酞辅酶A代谢产物甲羟戊酸(。evalonate)合成来调节相应基因表达的。 方法:【N-胸腺啼吱核昔酸(【h]TdR)掺入测定 VSMC DNA合成,流式细胞仪检 测细胞周期情况,Western印迹杂交法检测咋、p27及PTEN、c、ye蛋白表达,RT- PCR检测 PTEN mRNA的表达,人工合成 PTEN反义寡核昔酸,并以正义寡核昔酸为对 照,以脂质体介导转染细胞,以Western印迹杂交法检测转染效率并观测其对PTEN、 P27蛋白表达的影响。 0 结果:simvastatin以剂量依赖关系(lP M习0 u M)抑制血清诱导的 VSMC【℃-胸腺 啼唆核昔酸掺入,使G。/G;期细胞比例明显增多,S期细胞比例显著减少,并上调P27 及 PTEN的蛋白表达,但不影响 pZI、。hy。蛋白及 pEN iRNA表达,甲羟戊酸能抑制 simvastatin上调PTEN、p27蛋白的表达。NEV反义寡核昔酸下调PTEN蛋白的表达 后并不影响P27蛋白表达。 结论: 2 一 1、simvastatin能抑制 VSMC增殖,使细胞周期停滞于 GO/Gl期。 2、simvastatin抑制VSW增殖可能通过转录后调节机制分别调节PTEN、p27这两个 调控G;-S周期转换的基因而实现,对PZI、CttiyC $4不影呐,且PTEN与P27不 存在通常的上下游关系。 3、simvastatin对PTEN、p27的调节与其抑制3羟3甲戊H$辅酶A代谢产物甲羟 戊酸(mevalonate)的合成有关。 第二部分 辛世他汀诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡及相应信号转导机制 研究目的:观察SimVSStstin诱导大鼠VSMC凋亡及对凋亡相关基因B。X,BC12和半 眯天冬酶-3(caspase-3)表达的影响,并进一步探讨 Caz”及钙依赖中性蛋白酶 (。alpain)在sisvastatin诱导的大鼠VSMC凋亡中的作用及其在信号途径中的位 置。 方法:体外培养VSMC,透射电子显微镜技术、基因组DNA #胶电泳、流式细胞仪 PI/Annexin V双重染色等鉴定细胞凋亡;FuraZ/AM荧光探针法检测细胞内游离钙离 子浓度;荧光分光光度仪检测 calpain对特异性荧光底物 sue-LLVY-AMC裂解的活 性;WeSter11印迹杂交法检测BaX,B。卜2的蛋白表达及C。SPSSe-3的激活。 ’ 结果:30 pM ShoVastatin刺激 24h后,电镜显示 VSMC呈典型的凋亡形态, PI/nnexin y染色流式细胞仪检测凋亡细胞占(24.二士1.7)$显著多于对照组的(5.7?
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R965

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