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《浙江大学》 2002年
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HPO-205与EDAG基因的克隆与功能研究

闾军  
【摘要】: 哺乳动物新生肝及胚胎肝中存在特异刺激肝细胞增殖的细胞活性因子。1994年Hagiya等报道从新生鼠肝中分离出肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR),并完成其分子克隆。Hagiya等报道的ALR mRNA为1.2 kb,编码125个氨基酸组成,分子量约为15 kD的蛋白质,具有刺激肝细胞增殖的活性。随后一些研究发现在鼠肝组织中用Western blot可以检测到2.3-3.0 kD的阳性区带,并认为这可能与ALR具有同源二聚体结构有关。近来有研究发现,ALR实际上存在1.3 kb和2.7 kb两种转录形式,提示可能存在由不同翻译起始位点致不同翻译产物的可能性。1996年我国学者杨晓明等率先克隆出ALR的人类同源分子-肝细胞生成素(HPO)。人HPO由125个氨基酸组成,分子量约1×5 kD。新近,多个实验室报道了不同的人HPO/ALR/ERV1 mRNA序列,分析这些序列我们发现这些序列具有共同的3′端序列,而其5′端则长短不一,并且在编码人HPO起始密码子ATG前同一阅读框架不含有任何终止密码子。提示这些mRNA可能在5′端不完整。进一步分析人HPO基因组序列发现在HPO起始密码子上游同一阅读框上有另外一个ATG,并可形成一个较大的阅读框架。这些分析提示我们在体内可能存在新的HPO形式。 利用5’Race技术从人胎肝组织中分离一种新形式的肝细胞生成素(HPO-205)cDNA,其编码蛋白质氨基酸序列的N端较已报道人肝细胞生成素HPO(hepatopoietin)多80个氨基酸。其推测蛋白质分子量为23 kD。RT-PCR检测HPO m RNA在多种肝癌细胞中表达,Western blot可检测到23 kD HPO-205表达,表明此种形式HPO在自然状态下存在。将构建的HPO-205真核表达载体转染入COS-7细胞,其表达蛋白质能够刺激HepG2肝癌细胞DNA合成;将HPO-205、HPO和荷空表达载体分别转染人低水平表达HPO的Bel-7402肝癌细胞株,发现HPO-205比HPO具有较强的激活MAPK磷酸化的活性。细胞周期分析稳定转染HPO-205,HPO细胞的 博士学位论文HPry205与EDAG基因的克隆与功能研究 增殖周期也支持这一结论。这些结果表明HPO-205具有刺激肝源性细胞增殖的活 性,并提示HPO.2 05可能较HPO有更强的生物学活性。 研究胚胎发育过程中的基因选择性表达即基因特定时相的打开或关闭是阐明生 长发育调控机制的关键。脊椎动物红系造血的迁移是胚胎发育过程中的一个特殊事 件,在脊椎动物,红系造血最早源于卵黄羹的血岛(blood island),此时的细胞 是有核的,随后才迁人胚胎肝脏,大约在出生前转人骨髓造血,这样一个过程是公 认的研究细胞生长和发育的理想模型,因此研究胚胎肝特别是胚胎造血旺盛期肝组 织的选择性基因表达具有重要意义。 以表达性差异显示分析技术(W)获得一种在人胎肝组织中高丰度表达的基 因片段(命名为EDAG),经筛选。DNA文库及5,末端快速扩增技术m地id 孤呕1。f。cat。on of cDNA 5·end)获得其全长 cDNA 2,166 hp,该基因含编码 484个 氨基酸组成蛋白质的ORF,Blast捡索表明编码蛋白质不含任何已知蛋白质功能结 构域,与小鼠y及大鼠RPH基因同源。其W3,端非图译区序列含2拷贝 AUUUA结构,表明该基因稳定性差。体外翻译证明该基因编码蛋白质分子量为 55.3 kD,与理论预测值一致。Northern杂交及PCR检测表明该基因主要表达在成 人骨髓及胚胎肝组织,在K562和Mo7e两株人髓性白血病细胞系中也有较高丰度表 达。H。in及EPO(叮thropoietin)诱导K562细胞向红系分化过程中,EDAG的表 达随细胞的分化迅速下调;这些结果提示EDAG可能是一种与造血细胞分化调控密 切相关的新基因。 构建 EDAG真核表达载体 pcDNA3.工《+卜EDAG,以脂质体法将其稳定转染人 NIH3T3细胞中,结果发现高表达EDAG的NIH3T3细胞失去了正常的平行走向及接触 抑制现象,侵袭力较正常增强约10倍并获得了锚定不依赖生长能力。将该细胞株 皮下接种裸鼠,受鼠在4周左右100%(6/6)成瘤。这些结果表明EDAG是一种具 有转化活性的新基因,可能与肿瘤发生、发展密切相关。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R346

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