中国主要杂交水稻品种指纹图谱标记和鉴定技术的研究

【摘要】： 本研究应用同工酶、RAPD和SSR指纹图谱标记技术对我国目前播种面积较大的9个主要杂交水稻品种及亲本共29个材料进行了分析，建立了杂交水稻品种的酯酶同工酶、RAPD、SSR指纹图谱和指纹技术鉴定杂交水稻品种的标准参照程序，并对20个亲本材料进行了遗传关系分析，评估其遗传多样性及利用现状，对几份商品杂交稻进行了纯度分析，探讨其在生产上的实用性及应用前景。主要研究结果如下； 1、用于种子和幼苗对比，提取酶液和基因组DNA，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和PCR扩增。干种子的酯酶同工酶和过氧化物酶同工酶酶谱特征谱带同幼苗是一致的，使用干种子可以进行酯酶同工酶谱分析来鉴定杂交稻品种纯度，而且可以获得和幼苗相同的鉴定结果。用干种子提取DNA，最好是用CTAB法，其DNA质量较SDS法好。RAPD和SSR扩增结果都表明，CrAB法所提DNA，扩增产物稳定，条带清晰：而SDS法所提DNA，大部分引物无扩增产物，而且会出现条带缺失。用于种子提取DNA无须用液氮，不会出现DNA降解现象，经济实用。 2、酯酶同工酶在Est2和Est3出现父母本共显性谱带，较适宜做杂交稻品种鉴定和纯度分析。可以采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度为7.5％，pH8.9；浓缩胶浓度为2.5％，pH6.7；Tris-甘氨酸电极缓冲液(pH8.3)的电泳系统。理想的RAPD扩增反应体系为：12.5μl反应体积，10×PCR Buffer 1.25μl、模板DNA浓度5～50ng、随机引物浓度200μg/L、Mg~(2+)浓度2.0mmol/L、dNTPs浓度200μmol/L、Taq酶0.5U。反应条件为变性94℃30s，退火36℃30s，延伸72℃1min，40个循环，最后72℃10min，可不进行预变性处理，用1％的琼脂糖凝胶分离扩增产物。SSR扩增的反应体系为：10μL的反应体积中包括20ng的模板DNA、1.5mmol/L Mg~(2+)、0.36μmol/L 3′和5′端引物、0.2mmol/L dNTPs、5×SSR buffer2.0μl和0.5UTaq DNA聚合酶。反应条件为94℃预变性45s，94℃45s；56℃ 45s；72℃ 1min，30个循环，最后72℃ 8min。3％ Metaphor琼脂糖凝胶分离扩增产物。 3、酯酶同工酶、MPD、SSR相比。酯酶同工酶多态性水平较低，只有两条差 异谱带，可区分供试9个杂交组合中的威优46、汕优46、特优559、11优838与 其亲本，其它组合用酯酶难以区分。100个RAPD随机引物中，有28个引物具有 多态性，引物多态性频率为28＄。其中28个引物共产生清晰多态性片段48条， 每个引物可扩增出二～4条多态性片段，平均检测到二．72个片段。26对SSR引物 中，21对具有多态性，引物多态性频率高达87．5％。21对引物共扩增出多态性片 段69条，每对引物可扩增的多态性片段数为2～7条，平均3．29条。无论是引物 多态性频率，还是单个引物平均检测到的多态性位点数，SSR都明显高于RAPD。 RAPD为显性标记，单个引物很难同时区分开杂交种与其父母本，最好是双引物协 同鉴定。SSR为共显性标记，单引物完全可以同时区分杂交种与其父母本，如引 物RM228，一个引物可鉴别所有9个杂交组合与其父母本。 4、用RAPD和SSR对9个杂交组合的20个亲本材料进行邀传关系分析，两 种方法得到类似的聚类结果。所有亲本材料分为两个大的类群，不育系和恢复系 分别被聚为一群。在不育系中，11刁2A和冈 46At传距离最近，V20A、珍汕97A、 1132A和冈46A四个不育系聚为一组，正好这四个不育系都含有珍汕97的血缘， 亲缘关系较近，协青早A、龙特甫A之间以及与上面四个不育系的遗传距离较远。 根据聚类分析结果，可把6个三系不育系分为三类，即协青早A、龙特甫A各为 一类，V20A、珍汕97A、11十2A和冈46A为一类。恢复系之间的遗传距离相对不 育系要远。所有的不育系和恢复系分别被聚为两个类群，说明生产上主要应用的 杂交稻恢复系和雄性不育系遗传关系较远，从一定程度上反映了遗传距离与杂种 优势的正相关。超级稻两系杂交种两优培九双亲培矮 645和 93传距离最远， 杂种优势最强。 5、用酯酶同工酶、oD和SSR指纹标记技术对几份商品杂交稻进行了纯度 分析，结果基本与大田检验结果相吻合。基因型纯度要略低于田间纯度，这与杂 交种发芽率高于亲本发芽率有关。SSR标记具有简便、快速、稳定性好和等位基 因多态性高的特点，在杂交水稻的品种认证和纯度鉴定中有着广阔的应用前景。 6、本研究论文创新之处： Q）本研究中酶液提取、DM提取均采用干种子，并优化了提取方法，比 n 常用的幼苗和叶片提取方法更加快速、简便和实用。 （2）选用中国栽培面积最大的8个三系杂交稻和1个两系杂交稻作试验材 料，代表性强、覆盖面广。并用同一套材料系统地进行了同工酶、RAPD和SSR标