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《浙江大学》 2002年
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白菜雄性不育相关基因CYP86MF的功能验证及其人工不育系的创建

余小林  
【摘要】: 芸薹属(Brassica)作物是我国栽培面积最大,总产量最高的一类蔬菜与油料作物。同时它也是杂种优势利用最为普遍的一类作物,其雄性不育的选育及其应用基础的研究深受人们重视。近一个世纪以来对植物雄性不育的研究,国内外学者做了大量的理论和实验的探讨,在方法和指导思想上都有了明显的进步,不仅取得了一些重要的研究进展,还带动了杂种优势在生产中的广泛应用,产生了巨大的经济效益利社会效益。但是,雄性不育产生的机制仍然是一个尚未完全解开的谜,目前对其的认识是零散和不完全的,还有许多问题需要深入研究。随着现代生物学,尤其是分子生物学理论与技术的发展,不仅为最终解决植物雄性不育机制提供了条件,而且随着这个问题的解决过程,也将大大推动芸薹属和其他农作物杂种优势的有效应用。 在国家自然科学基金委的资助下,我们在前一阶段利用mRNA差异显示技术从白菜(B.campestris ssp.chinensis(L.)Makino Var.communis Tsen et Lee)核雄性不育两用系中分离得到了一个与白菜核雄性不育相关的编码细胞色素P450基因CYP86MF。该基因具有一个完整的长1578bp的开放阅读框,经GenBank BLAST查询表明,CYP86MF与位于拟南芥第一条染色体上的编码细胞色素P450基因CYP86C4核苷酸序列有85.3%的同源性,氨基酸同源率为84.9%;Northern验证表明CYP86MF基因在白菜两用系不育株中的表达受到了明显地抑制,并且该基因在花蕾中特异表达,而在叶片和茎中不表达。为进一步了解本实验室获得的CYP86MF基因的生物学功能,在建立了白菜和菜心的高效再生体系,以及构建了植物表达载体的基础上,我们采用反义技术将可育株高表达的CYP86MF基因中约460bp的片段导入正常可育白菜和菜心(B.campestris ssp.chinensis(L.) Makino var.parachinensis(Bailey)Tsen et Lee)中,得到了130多株转化植株,其中开花结果的有37株,除2株为嵌合的不育株以及3株的花器官畸形(花朵变大、花瓣变窄以及嵌套花)以外,其余的转基因植株花器官外观形态正常,但单株自交不能正常结实,蕾期授粉亦然。由此我们进行了转基因植株的花粉萌发试验,结果显示,转基因植株的花粉不能正常萌发,而非转化对照株的花粉萌发率可达25%~30%。由此,我们分析了转基因不育植株与正常可育植株及其两用系材料之间CYP86MF基因的表达特征,对转基因植株及其对照株之间的小孢子的形态和细胞发育过程进行了观察,比较了它们之间有关生理生化指标的差异,从而为探讨CYP86MF基因在芸薹属植物小孢子发育过程中的作用机制提供了一些信息。主要研究结果如下: (1)通过不同浓度的激素配比以及采用不同外植体的筛选,提出了一个白菜离体培养再生频率较高的培养基配方(1/2倍浓度NH_4~+的MS培养基的盐类及维生素+2%蔗糖+0.8%琼脂+2mg/L BAP+0.45mg/LNAA+7.5mg/L A9NO_3+80mL/L椰子汁),大幅度提高了植株的再生频率,达到84.8%以上。成苗周期大大缩短。子叶-子叶柄外植体接种后,最早的仅需6d即可分化出不定芽,从接种到再生苗的移栽最快的约需40d,平均一批约需50d,再生植株移栽的成活率达到 r ¥ 2 g Wtq&tet HWks#t+HhiX4NCYPS。。FMf)J能&证RitA。个fgNJ创4 f 95%以上,达到了高频快速的要求。该培养基对白菜类蔬菜的不同品种有着较广的适应性。此外,8 还发现白菜类蔬菜的再生特性具有较强的基因型背景,其中青梗类白菜的不定芽再生能力优丁肉梗I (2)建立了改良的菜心离体培养再生体系,其分化及生长培养基的配方为:1/2倍浓度NH。“ 的 MS培养基的盐类及维生素+2%蔗糖+0石%琼脂+2 mg/L BAP+0厂5-I刀 mg/L NAA+ v·s mg/L a+NO。+80 mL几椰于汁。 (3)沟建了反义CYP86Ag’基因的 CaMV35S组成型表达载体pBI35S-AMF和 Ag绒毡层组织 特异型表达载体pB[Ag-AMF。检测鉴定后,分别将它们导入农杆菌LBA4404和 EHA105 l株中。 (4)经过对自菜和菜心Kan筛选浓度的确定、预培养和共培养时]司的筛选,以及不同状杆卤S 菌株的比较,建立了Southern印迹杂交阳性频率高达2.48%的白菜高效坦传转化体系。具体操作为:8 将于叶柄-于叶外植体在预培养基上预培养 3 d后,用 LBA4404/(pBI35S-AMF和 pBIAg-AMF)感 染 10-15 min,在灭菌滤纸上吸干菌液,置于共培养培养基上培养 2 d,随后将外植体转入含 10 mgh Kan的选择分化培养基上诱导不定芽,3周转瓶一次,当抗性幼苗K至2~3 cm时,在愈伤组织处 切下幼苗,置于生根培养基上诱导不定根,20 d左
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:S634.3

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【引证文献】
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【共引文献】
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10 刁现民;王永芳;李伟;王鹏;智慧;陈振玲;段胜军;;抗除草剂基因Bar转化谷子研究[A];2003年全国作物遗传育种学术研讨会论文集[C];2003年
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【同被引文献】
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7 张豫超;白菜雄性不育相关基因BcMF10的功能验证[D];浙江大学;2006年
8 黄细松;白菜开花时间相关基因的分子标记及春化相关基因的克隆和表达分析[D];浙江大学;2006年
9 陈鹏飞;大白菜类胡萝卜素分离鉴定和积累机理与调控研究[D];扬州大学;2008年
10 李勇;红菜苔春化作用相关基因及其天然早花突变的分子机理研究[D];重庆大学;2009年
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