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br基因的定点突变和表达

潘笑娱  
【摘要】: 细菌视紫红质(bacteriorhodopsin BR),是存在于极端嗜盐菌(Halobacterian halobium)紫膜上的唯一蛋白。一个BR分子包含一分子细菌视蛋白(bacterioopsin,BO)和一分子视黄醛。BR有光驱动质子泵的功能,耶的光循环就是一个质子传递的过程,光照下,BR的分子构型发生一系列的瞬间变化,产生不同最大吸收峰的“光循环中间体”。BR经历一系列中间体及亚稳态回到原初态,形成一个光循环:BR_(570)—〉K_(590)—〉L_(550)—〉M_(410)—〉N_(550)—〉O_(640)—〉BR_(570) BR所具有的结构和功能上的特殊性质使其成为最有研究价值的蛋白之一。它的质子泵功能使BR作为最有前途的光敏蛋白,应用在光电转换器,信号储存和光学检测等多种方面。 本论文利用连续PCR的方法定点突变了br基因的一个氨基酸,突变位点选择了br基因第273的T和274位的A,把它们变为CG(Tyr替换为Arg),然后把突变的br基因克隆入嗜盐菌表达载体Pnov-r,经测序鉴定的表达载体转化BR缺陷的嗜盐菌,构建了Tyr79→Arg BR突变体。PCR检测和Western-blot都说明了突变蛋白已经成功的在嗜盐菌中表达了。嗜盐菌应该是BR天然的理想的表达宿主,比较其他的BR表达系统,如大肠杆菌等,同种表达系统可以研究BR在天然晶格中的状态并且能够避免异种表达系统的许多缺点。突变后的蛋白经生物信息学软件分析了和野生型BR的不同。 Tyr79→Arg BR突变体的光电特性还要进一步分析和测试。br基因的定点突变改造和突变基因在嗜盐菌中表达系统的建立使我们可以研究BR的各种突变蛋白。通过观察各种BR的突变蛋白在结构和光学性能上的变化,从而确定BR结构和功能上的关键氨基酸,使我们更深入得了解蛋白质结构和功能之间的关系。而且经遗传工程改良的BR蛋白质分子,往往具有一些新的光电特性,与天然BR相比,更适于用作生物分子器件的材料。我们的研究工作为以后更广泛更深入的改良BR奠定了基础。


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