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《浙江大学》 2003年
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白菜核不育两用系育性基因表达特征分析及其小孢子发育相关基因的分离

王永勤  
【摘要】: 白菜(Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino)属十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种,原产我国,栽培历史悠久,品种资源十分丰富,是中国蔬菜作物中栽培面积最大的一种。白菜在我国农业生产和人民生活中占有非常重要的地位。白菜为典型的异花授粉作物,具有明显的杂种优势。因此,雄性不育的机理及其应用研究一直深受人们的重视。雄性不育产生的机理十分复杂,涉及到小孢子发育的一系列结构基因和调节基因。要彻底搞清雄性不育产生的机制,必须搞清楚小孢子发育过程中的相关基因。从一对等位基因控制的雄性不育两用系入手,是解决这一问题的最佳途径。本研究以‘矮脚黄’白菜(B. campestris L. ssp. chinensis Makino var. communis Tsen et Lee cv. Aijiaohuang)隐性核雄性不育两用系(A/B line)为材料,从形态、生理生化、分子水平上,对可育株系和不育株系的时空表达特征进行研究,并分离与小孢子发育相关的基因全长,取得如下结果: (1)对‘矮脚黄’白菜核不育两用系中不育株系和可育株系田间生长状况、生理生化指标进行了比较研究。结果表明,不育株花药廋小,没有花粉或花粉畸形;莲座期不育株系和可育株系植株整齐一致,开花期不育株系株高显著高于可育株系,其主要原因可能如我们发现的,不育株花蕾抗氰呼吸强度低于可育株,与消耗能量少有关;可育株系与不育株系叶绿素含量、光合作用差异不显著;不育株系花蕾的IAA缺乏,而ZT盈余;不育株系的中花蕾和大花蕾过氧化物同工酶带强于可育株系,但小花蕾和不同时期的叶片未见差异;不同时期可育株系和不育株系叶片和大花蕾之间的细胞色素氧化酶同工酶未见差异,而可育株系中的小花蕾和中花蕾的两条特异的带强于不育株系;可育株系的中花蕾可溶性蛋白电泳表现出两条特异带,而不育株系的中花蕾只有一条特异带。 (2)以花柄为外植体,对白菜核不育两用系再生体系进行了研究,表明花柄外植体表面消毒需要75%酒精处理30s和0.1%升汞处理9min。不同浓度配比的6-BA和NAA对外植体芽的再生和再生曲生根有着不同的影响,不育株的最佳激素组合为2mg/LBA+0.2mg/L NAA,其诱导不定芽再生频率达75.0%;可育株的最佳激素组合为2mg/LBA+0.1mg/L NAA,其诱导再生频率达65.6%;生根培养基以1/2 MS培养基附加0.1mg/L NAA和7.5mg/LAgNO_3为最佳。 (3)对cDNA-AFLP技术体系进行了优化研究,表明cDNA-AFLP预扩增适宜退火温度为53℃,预扩增循环次数为20个循环,预扩增和选择性扩增PCR体系中Mg~(2+)浓度均为2.3mM。对白菜核不育两用系进行cDNA-AFLP分析表明:可育株系和不育株系的花蕾之间表达存在差异,而莲座期叶片、开花期叶片和花茎之间基因表达无差异;两用系的叶片、花茎和花蕾三者之间的基因表达存在差异。对开花期的小蕾、中蕾和大蕾分析显示:22对引物中,3对引物在可育株中蕾和大蕾中有4条特异带,1对引物在可育株中蕾中有1条带表达丰度高于不育株中蕾。对其中表达丰度有差异的基因片段进行Northern验证,其结果与cDNA-AFLP结果一致。这说明cDNA-AFLP技术可以用于植物雄性不育基因表达差异的研究。 (4)利用A15T17引物对白菜核不育系两用系不育株系与可育株系表达差异进行cDNA-AFLP分 摘 要 析,在可育株系中蕾和大蕾中发现一条特异表达条带(BCMFotl5T17)。Northern杂交证明该基因只 在可育中蕾和大蕾中特异表达。利用 RACE技术得到该基因 cDNA全长,全长为 1683 hp;该基因全 长 1983 hP,含有3个内含子,将该基因命名为 BCMF。经BLAST查询对比,该基因碱基序列与拟南 芥中的一个未知功能基因有较高的相似性:与该基因有一定相似性的其它基因的功能全部未知。 BCMPI的最大ORF从第76号碱基开始,第1419号碱基终止,1344个碱基编码447个氨基酸。 (5)用A18T16引物对白菜两用系不育株系与可育株系的表达差异进行CDNA-AFLP分析,发现 可育株系的中蕾和大蕾中有两条特异表达的条带,分别命名为 BCMFA18T16.l和 BCMFA18T16.2。 利用RA*E技术得到**M卜A18*16-ICDNA全长序列,其全长为1485 hp,将该基冈命名为 BCMn。Northern杂交表明该基因只在可育中蕾和大蕾中特异表达。经BLAsT f询对比,其全序列 与拟南芥多聚半乳糖醛酸酶M序列具有 83%(764ill52)的相似性JCMF最大Ony为 1263 hP, 起始密码子ATG位于第67位,终止密码于为TAA,位于第1329位,其编码420个氨基酸。 利用RACE技术分离了BCMF-A18T16-2片段相关基因的全长,其长度为2077hp,将该基因命名 为BCMH。RTPCR分析表明该基因只在可育中蕾和大蕾中特异表达。经BLAST查询对比,其全序 列与大白菜的果胶甲酯酶 MA有 92%(1590/171)相似性。BCMF3最大 ORF为 1755 hP,起始 密码于M位于第157位,终止密码子为TAA,位于第1911位,编码584个氨基酸。 (6)用A17T14引物对白菜核雄性不育两用系不育株系与可育株系的表达差异进行cDNA-AFLP 分析,发现可育株系的中蕾和大蕾中有一条特异表达的条带(BCMPotl7T14)。RTPCR表明该基因只 在可育
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S634

【引证文献】
中国期刊全文数据库 前3条
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中国重要会议论文全文数据库 前1条
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中国博士学位论文全文数据库 前3条
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中国硕士学位论文全文数据库 前7条
1 符庆功;白菜核不育两用系基因组AFLP差异片段筛选、克隆及序列分析[D];浙江大学;2003年
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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国博士学位论文全文数据库 前3条
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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7 张晓东;李利斌;宋宜现;李化银;刘立峰;高玲;高建伟;;大白菜高效稳定遗传转化体系的建立[J];山东农业科学;2010年02期
8 许会会;赵美爱;钤泰琳;刘维信;;农杆菌介导的薹菜遗传转化体系研究[J];山东农业科学;2011年05期
9 苏学军;徐茂俊;金刚;赵传双;张涛;孔德禄;张吉祥;;大白菜质核互作型雄性不育的转育与应用[J];山东农业科学;2011年06期
10 张庶;李利斌;王凤德;刘立锋;李化银;高建伟;高玲;;利用cDNA-AFLP分析大白菜、萝卜及其杂交种差异表达基因[J];山东农业科学;2011年07期
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【同被引文献】
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中国重要会议论文全文数据库 前1条
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【二级引证文献】
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【二级参考文献】
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