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《浙江大学》 2003年
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受稻瘟病菌诱导的水稻RIM2因子超级家族的分子遗传

田平芳  
【摘要】: 越来越多的研究表明,植物在受到不良环境胁迫时,如组织培养、辐射或病原物侵袭等,会发生转座行为。由于转座子的跳跃而使其拷贝数增加,从而使植物基因组的可塑性增大。Rim2是水稻中能够受稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)及其激发子强烈诱导的一个新因子,经对其全长cDNA克隆分析,发现其预测编码蛋白与En/Spm家族的多种植物转座酶具有同源性。由此推断,水稻基因组中可能存在类似En/Spm结构的转座因子。 为揭示Rim2因子的DNA分子结构,本研究采用Rim2 cDNA片段作探针,筛选水稻BAC文库,获得了若干阳性BAC。对其中的6C9、7I18、21C8、22H17和22N5进行亚克隆,获得了Rim2-228、Rim2-248、Rim2-553、Rim2-569、Rim2-411等20多个阳性片段。经序列分析、数据库检索、荧光原位杂交(FISH)、Southern杂交以及PCR检测证明,Rim2因子属于一个与CACTA家族具有明显差异的新的转座子大家族,有关结论如下: 1.Rim2因子具有ClassⅡ转座子的基本核酸结构,但属于新的DNA转座因子对Rim2-228等阳性片段测序,然后在GenBank中进行Blast检索,发现这些阳性片段在水稻基因组中存在大量同源序列,并且分布于所有染色体上。对这些阳性片段所在BAC序列的上下游进行搜索,发现了16-bp完整的末端颠倒重复序列(Terminal inverted repeats,TIRs)CACTGGTGGAGAAACC。与En/Spm、Taml以及Tgml等转座子相比,Rim2末端的五个碱基不是CACTA而是CACTG,表明Rim2因子与以往报告的CACTA转座子存在较远的亲缘关系。此外,Rim2因子插入位点均具有3-bp的同向重复。利用DNAStar软件中的GenQuest程序,从Rim2因子中发现了若干正向和反向的16-bp的亚末端重复序列(Subterminal repeats,STRs)ATCTTTAGTCCCGGTT,以及较长的串联重复序列(Tandem repeats,TRs)。这些因子携带一个开读框,没有内含子,其预测编码蛋白与TNPD/TNP2等植物转座酶具有低度同源性。另一方面,这些Rim2因子不含与TNPA/TNP1同源的开读框,推测该开读框在进化过程中缺失或由于其它因子的插入而遭到了破坏。 2.Rim2因子为一转座子超级家族,在染色体上呈不均匀分布利用这些阳性克隆的保守序列进行Blast搜索,从GenBank中230Mb水稻序列中找到了344个类似结构的Rim2因子,推算在整个水稻基因组(430~460Mb)应有600~700个拷贝。染色体原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)结果清楚显示,Rim2因子在染色体上广泛分布,与数据库检索结果相吻合。为详细了解这些因子在染色体上的分布情况,我们将这些因子进行了染色体定位作图,结果显示Rim2因子在染色体上分布不均匀,以着 浙江大学博士学位论文2 丝点区域分布频率为最高。这些研究表明RimZ因子为一个超级家族。 通过计算RimZ因子旁邻序列的AT含量,发现它们具有插入AT丰富区域的偏好性。 在靶位点重复(Tyetsite duplication,TSD)外侧 500hp范围内,5’端 AT含量为 58.2-59.4%, 3’端AT含量为60.9-62刀%,而随机挑选水稻序列的AT含量为56.3%。同时,我们还对RimZ 因子插入基因的情况进行了统计。在现有的344个因子中,204个因于所在的基因在GenBank 中己有注释,其中 44个因子插入基因的编码区,占 ZI石%;101个因子插入基因内含子或紧 靠基因的5’端或3’端,占49.5%;这两种情况合计共占刀.l%。只有59个因子插入基因之 间,仅占28.9%。该结果说明Ri。二因子可能通过某种机制影响基因的结构和表达。 3.RII,12超级家族因于之间存在多样性,并曾经发生过转座行为 序列分析表明,RimZ因于在核酸和蛋白质两方面均存在多样性。利用NCBI中的Ogy Finder程序对检索到的RimZ因于进行了编码能力预测,根据结果可将这些因子分为3个亚 组:口)编码亚组(2)假基因亚组(3)非编码亚组。编码亚组Ril。2因于的Ogy(Open readng frame)在仗度上存在差异,许多因于的两端出现缺夫,以N端缺失者居多。RimZ因于的长 度不一体现了进化过程。然而,编码亚组的某些因子不仅其预测编码蛋白高度保守,而且它 们的DNA序列也高度同源,推断是由于最近的转座行为造成的。Resite搜索结果说明RimZ 因于曾经发生过活跃的转座。假基因亚组是由于移码突变等造成的。」「编码亚组Ri;,;2因于 人多较短,可能属于非自主性转座因子。 4.RimZ因于与CACTA家族转座子具有较远的进化关系 提取禾本科植物水稻、大麦、小麦、玉米、谷子、高粱和拟南芥的基因组DNA以上 述 Ri)nZ cDNA Rim.8为探针,进行 S。uthern杂交,结果只有水稻子 pll性。这说明 Ril。2 冈于编码序列为水稻基因组所特有。用邻接法构建的进化树显示,Ri。2因子与CACTA因 于具有较远的余缘关系。 5.Rin;二因于广泛分布于所有供试水稻品种中,其编码序列在品种间有差异,可用于品种 指纹鉴定 以 26个不同起源水稻品种的基因组 DNA为模扳,以 RimZ cDNA片段 Rim.8为探针, 进行 Southern杂交,结果表明,RimZ因子多拷贝存在于所有供试品种中。根据 RimZ cDNA 序列设计引物进行PCR反应,结果显示品种之间编码序列上的差异。为此,我
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S435.111

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