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《浙江大学》 2003年
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阴沟肠杆菌β-内酰胺酶编码基因及调控研究

周志慧  
【摘要】: 细菌产生β-内酰胺酶是革兰阴性杆菌最重要的耐药机制,当前最具临床意义的β-内酰胺酶是超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)和AmpC酶,造成细菌对第三代头孢菌素及其它β-内酰胺抗生素的高度耐药。而在阴沟肠杆菌中既存在AmpC酶的问题,又存在ESBLs的问题,耐药情况更为严重,给临床治疗造成了更大的难题。 ESBLs在Bush分类中属2be类酶,能分解第三代甚至第四代头孢菌素,可被β-内酰胺酶抑制剂所抑制。AmpC酶属Bush分类中的1类酶,能水解第三代头孢菌素,不被β-内酰胺酶抑制剂所抑制,编码基因为ampC基因,其表达往往可被β-内酰胺抗生素所诱导。AmpC酶与ESBLs这两种酶的性质不完全相同,分解的抗生素底物也不一样,产不同类型酶的细菌感染需选用不同抗菌药物,因此明确阴沟肠杆菌中产ESBLs、产AmpC酶及同时产两种酶的比例非常重要。目前美国临床实验室标准化委员会(National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS)尚无推荐的检测阴沟肠杆菌AmpC酶及ESBLs的方法,建立一种简便易行的检测阴沟肠杆菌AmpC酶及ESBLs的实验室方法,对指导临床用药有重要意义。 有关AmpC酶与ESBLs的问题是目前肠杆菌科细菌感染面临的最大问题,牵涉到阴沟肠杆菌、沙雷菌、摩根菌、弗劳地枸橼酸杆菌、肺炎克雷伯菌等许多菌株,其中最有代表性的是阴沟肠杆菌,且在临床上阴沟肠杆菌的感染日趋严重,其耐药性在国内远较国外严重。本研究以阴沟肠杆菌为主要菌种,对AmpC酶与ESBLs 浙江大学2003届博士学位论文 在阴沟肠杆菌耐药中的作用,阴沟肠杆菌中ampC基因的表达调控及ESBLs的基因 型进行深入研究。 1.阴沟肠杆菌AmpC酶表型筛选方法的建立 建立一种新的简便易行的 AmpC酶的表型筛选方法,并对 144株阴沟肠杆菌进 行检测,与三维试验结果比较,不符合的菌株进行等电聚焦试验和氯哩西林抑制试 验* 株阴沟肠杆菌表型筛选结果显示高产 AmpC酶的菌株共有 3 5株,占 24.31% (35/144)。表型筛选与三维试验相比总符合率为 89.58%(129/144)。2种方法检测 结果相符的菌株129株,三维试验结果可疑的菌株10株,两种方法检测结果相反的 菌株有5株。结果相反的5株菌株中,4株菌株的等电点条带均不能被氯哇西林抑 制,另1株菌株等电点检测有5条条带,其中2条被氯哩西林抑制。提示表型筛选 法检测AmpC酶结果可靠,方法简便,易于在临床实验室中推广应用。 2.阴沟肠杆菌耐药及a呷C基因表达状况研究 采用纸片扩散法检测阴沟肠杆菌的药敏情况,聚合酶链反应法检测ampC基因, 根据耐药表型对)W)C基因表达状况进行分析。结果显示1叩株阴沟肠杆菌对亚胺 培南的敏感率高达98石1%,对头抱毗胎和头抱派酮/舒巴坦的敏感率分别为65.97% 和 63.89%,但对阿莫西林/克拉维酸、头抱味辛等抗菌药物的敏感率较低。120株菌 株ampC基因阳性(占83.33%),其中33株高水平表达(占27.50%),45株诱导表 达(占37.50%人未表达或低水平表达的有42株(占35刀0%人诱导产AmpC酶的 菌株除对阿莫西林/克拉维酸和头殉味辛敏感率低外,对其他抗菌药物的敏感率均在 90%以上;而高产AmpC酶的菌株仅对亚胺培南和头抱毗sh的敏感率在85%以上, 如合并产 ESBLS,则对头抱毗sh的敏感率下降。提示阴沟肠杆菌耐药状况严重,而 ampC基因的表达状况不同,其耐药程度也不同,因此明确AmpC基因表达状况有 助于临床抗菌药物的合理使用。 3朋沟肠杆菌a呷R、a…基因突变与a呷C基因表达的研究 随机选取表型筛选为高产AmpC酶的阴沟肠杆菌6株和非高产的阴沟肠杆菌1 株,检测 7株菌株对 11种抗菌药物的敏感性及所产酶的等电点,井通过 PCR法检 2 浙江大学2003届博士学位论文 测 ampD和 a呷R基因,克隆测序。结果显示 6株表型筛选为高产 AmpC酶的菌株 对第三代头泡菌素、复合制剂及单环酚胺类抗生素高度耐药,而另1株(41号)表 型为非高产AmpC酶的菌株对第三代头抱菌素和氨曲南均敏感,且等电聚焦检测到 pIS为 7.82和 6.75的两条条带,均不被氯哩西林所抑制。6株表型为高产AmPC酶 的菌株,等电聚焦检狈到多条条带,其中… 为7.19,7.40,7*8,8.10,8.30,9*4 等条带能被氯哩西林所抑制刀株菌株经pCR扩增,均获得423hp和849hp的。pD 和 a…片段,与 41号菌株序列比较,显示 3株高产 AmpC酶菌株的 ampD基因存 在氨基酸点突变,其突变位点变化为 His刁-Tyr,Pro62—Ser,Phe*3~乃r,Try习5 —Arg,Met of—Lys。ampR检测中提不氨基酸突变包括*64-Val,Thr-106—lie, Gin-114一Asp,Ser-136一Pro,Ala二75一Thr,Ser-179一Cys,ATg-279~Cys,尤其 是点突变Serf79—C
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R346

【参考文献】
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