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《浙江大学》 2003年
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成骨细胞、生长因子复合生物活性支架的骨再造研究

朱慧勇  
【摘要】: 颌骨缺损是口腔颌面外科的常见问题,可由炎症、外伤、肿瘤等原因造成,其中肿瘤性的颌骨缺损在临床上更为多见,口腔恶性肿瘤手术往往导致下颌骨或上颌骨的缺损,如何进行功能性的骨缺损修复(包括颌骨缺损修复)成为临床上一个重要的研究课题,也为肿瘤外科术后修复重建的重要问题之一。目前临床上使用的修复方法虽很多,但仍有一定的缺点,组织工程学是一门新兴学科,主要致力于组织和器官的形成再生,其最大优点是所形成的组织具有功能和活力,具有与机体相同的组织结构,因此采用组织工程技术进行颌骨缺损的修复,具有十分深远的临床应用价值。 组织工程内容包括三个基本的要素,即种子细胞、细胞生长和分化的调节因子和细胞外基质材料(生物可降解支架材料)。骨组织工程种子细胞即成骨细胞目前多由骨髓来源,骨髓基质细胞能在体外培养诱导分化为成骨细胞,但存在传代后细胞老化、功能减弱等问题,因此需要采用生物活性因子来调节其生长和分化,目前较为公认的是骨形成蛋白-2,而随着基因工程产品的出现,其应用也日趋广泛。支架材料的选择也十分重要,材料与细胞必须有良好的亲和性及粘附性成骨细胞才能在材料表面、生长增殖和分化,采用不同的生物可降解支架材料的复合应用于口腔肿瘤术后骨缺损的组织工程修复尚未见报道。生长因子的载体目前报道较多,人工合成的生物可降解支架作为生长因子的缓释载体应用于骨组织工程,并进行释放和活性的系统评价目前国内尚未见报道。因此本研究重点研制一种复合的新型生物可降解支架,它不仅具有生物活性即与细胞有良好的亲和性及粘附性,而且含生长因子缓释系统。把原代培养的成骨细胞在生物活性支架上混合培养后植入自体动物内来观察其体内成骨的情况,进而评价采用组织工程技术构建特定形态骨组织的可行性,为今后进行各种原因导致的骨组织缺损的修复具有十分重要的临床意义。 浙江大学博士学位论文 本课题分四个方面进行研究: 第一部分 成骨细胞的原代培养及生物学特性研究 为了建立一种骨髓基质细胞向成骨细胞转化的体外培养方法和骨组织工程种 子细胞的动物模型,本研究以家兔和正常人骨髓为实验对象,分别抽取骨髓约3ml, 利用密度梯度离心培养法和全骨髓培养法进行成骨细胞的原代培养,加入诱导分化 剂 50 u o/ml维生素 C、10mmol几 B甘油磷酸钠、10smol几地塞米松,再进行传代 培养。培养的成骨细胞进行生物学特性鉴定,包括相差显微镜观察细胞的形态及矿 化小结、HE切片染色观察细胞的形态、改良Gomonri钙-钻法进行碱性磷酸酶染色、 Von Kossa染色观察钙结节形成、扫描电镜观察细胞的形态、流式细胞仪检测细胞 周期及DNA分析、流式细胞仪分析造血系标志CD80、CD38、CD34、CD45和非造血 系标志CD29、CD44的细胞阳性率,从以上七个方面来验证成骨细胞的形态、分化 功能及细胞免疫学特性。 结果显示,骨髓基质细胞24-48小时后即可贴壁,在诱导剂作用下可进行分化, 细胞呈多种形态,有三角形、星形、多角形及长梭形等,并形成多种胞浆突起,细 胞呈集落生长趋势。至二周左右,细胞融合成单层,形态多转为梭形;细胞培养一 月后,在集落中央可见钙化点。HE染色光镜观察细胞形态为长梭形、三角形、多角 形,有多个树状突起,细胞呈集落样生长。碱性磷酸酶染色阳性显示为棕色或黑色 颗粒。钙结节染色阳性钙化点处可见棕褐色沉着物。扫描电镜观察细胞呈多种形态, 有多个突起,细胞突起相互连接,符合成骨细胞形态。原代培养的第3代成骨细胞 细胞周期及 DNA分析:G。ol的比例为 88.4%,GZ+S的比例为 11.6%,3T3细胞株细 胞周期及DNA分析:G。d;的比例为79.7%,G。+S的比例为20.3%。人原代成骨细胞 CD分子测定的细胞阳性率CD29、CD44、CD80、CD38、CD34、CD45分别为59.00%、 71.52%、2.27%、5.86%、22.08%、71.45%。 以上结果表明骨髓中的骨髓基质细胞可作为在骨组织工程中获取成骨细胞的 来源,骨髓基质细胞经诱导分化后可转化为成骨细胞,经过生物学特性鉴定为成骨 细胞,培养的成骨细胞具有高分化潜能,可用作组织工程骨再造中的种子细胞来源。 3 成骨细胞、生长因子复合生物活性支架的骨再造研究 第H部分 重组人骨形成蛋白-2对兔骨髓基质细胞增殖分化作用 的研究 骨形成蛋白与成骨细胞的增殖和分化密切相关,而且应用于骨组织工程有望提 高其成功率。为了探讨基因重组人骨形成蛋白对成骨细胞来源的骨髓基质细胞的影 响,研究了不同浓度的 rhBMP-2(25、50、100、200、400、500ng/ml)对骨髓基质 细胞增殖和分化的影响。采用MTT法研究不同浓度的rhBMP-2对骨髓基质细胞增殖 的影响,并与空白对照组相比较,结果显示小于 500ng/ml实验组的 OD值与对照组 均有显著性差异(P<0.05或<0.01),但作用浓度为100ng/ml时其OD值达到最高 (017
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R318.17

【引证文献】
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【同被引文献】
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