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《浙江大学》 2003年
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壳寡糖对经IFN-γ预刺激的巨噬细胞IL-1β、TNF-α基因表达的影响

纪莹  
【摘要】: 甲壳质,又名几丁质,是自然界最丰富的生物资源之一,具有多种生理功能,广泛应用于各种行业中。但是,几丁质不溶于水限制了它的应用,往往需要对它进行一些化学修饰或部分降解以增加其溶解性。几丁质部分脱乙酰化产物是壳聚糖,它们的降解产物为几丁寡糖、壳寡糖,具有较好的水溶性,易于分散吸收。众多学者研究发现几丁质、壳聚糖及几丁寡糖、壳寡糖具有免疫调节作用。将这些多糖、寡糖经腹腔或静脉给予小鼠,可以使其腹腔渗出液及外周血中多型核白细胞增多,巨噬细胞、脾脏T淋巴细胞、NK细胞等活性增强。各种免疫功能细胞激活后,分泌各种免疫活性分子,如白细胞介素、肿瘤坏死因子及干扰素等。通过这些分子介导免疫功能细胞互相调节,增强免疫细胞的活性,巨噬细胞释放过氧化氢、一氧化氮等活性物质,T细胞、NK细胞的细胞毒活性增高,整体免疫系统功能增强。几丁质及其衍生物通过调节机体免疫系统功能,能增强机体对多种病原微生物的抵抗作用,对实验性小鼠Meth A纤维肉瘤、S180肿瘤、MM44实体瘤及Lewis肺癌等肿瘤细胞的生长具有抑制作用。 研究表明壳寡糖具有免疫调节作用,有抗感染及抗肿瘤活性。但众多研究以动物整体实验为主,关于壳寡糖对免疫系统某一特定环节直接作用的研究较少。为了探索壳寡糖对免疫系统调节作用的机理,本课题以小鼠巨噬细胞作为研究对象,通过体外实验将壳寡糖作用于巨噬细胞,并在壳寡糖作用前加入IFN-γ对巨噬细胞进行预刺激,运用相对定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术和酶联免疫吸附实验(ELISA)技术,检测壳寡糖对巨噬细胞 浙江大学硕士学位论文 ILl、TNF—a基因转录水平和翻译水平的影响。 首先确定壳寡糖对巨噬细胞作用的最适时间和最适浓度:通过RT干CR 确定最适作用时间为 18h,同样的方法先确定壳寡糖作用浓度范围为 5~50 n g加*在此范围内进一步实验发现 10~60 n g/ml的壳寡糖能增强巨噬细胞 IL-lP和 TNF-a基因转录,效应有剂量依赖性。选定 40 n g加l浓度的壳寡 糖继续作用于巨噬细胞, 然后确定IFN-Y预刺激的最适时间和最适浓度,实验组加入IFN-Y预 刺激后再加壳寡糖,对照组仅加壳寡糖,继续培养 18h,通过 RT干CR确定 IFN-Y最适预刺激时间为 4h,最适预刺激浓度为 100U/ml。此外,由于 IFN-Y 单独作用也可促进两种细胞因子基因表达,故在巨噬细胞中加入IFN-Y单独 作用 22h,再经阿一PCR检测,发现加 IFN-Y的实验组细胞的几一lp和 TNF- a基因转录水平与空白对照组相比较无显著性差异,可见,壳寡糖和IFN-v 对巨噬细胞 IL-lp和 TNF一口基因转录水平的影响在作用时间上无一致性,在 壳寡糖作用最适时间时,仅受 IFN-Y刺激的巨噬细胞 IL-lp和 TNF-Q基因 转录己下降至刺激前水平,因此可以认为,IFN-Y的加入仅起到对巨噬细胞 预刺激使之处于敏感状态的作用,有利于增强壳寡糖对巨噬细胞的作用。 在确定了壳寡糖和IFN-Y的最适作用时间及最适作用浓度之后,选取三 组细胞状态良好,数目比较一致的巨噬细胞,实验组中加入 100U/ml IFN-v 预刺激 4h后,再加入 40 u g/ml壳寡糖,加糖对照组则只加 40 n g砌l壳寡糖, 空白对照组两者都不加,继续培养18h。收集实验组和对照组上清培养液留 待ELISA实验用,巨噬细胞通过异硫氰酸脱一酚一氯仿一步法提取总RNA。 RT-PCR结果表明两种细胞因子基因转录水平明显提高,加糖对照组 IL一互 p和 TNF-a基因转录水平分别为空白对照组的 2.l倍和 1.9倍…<0.of人 实验组 IL-lp和 TNF-a基因转录水平分别为空白对照组的 3.7倍和 4.3倍b <0.01)。 ELISA实验结果显示,两种细胞因子分泌也显著增多,加糖对照组IL-l p和 TNF-a分泌量分别为空白对照组的 2.4倍和 2倍b<0.of人实验组几 刀 p和 TNF-a分泌量分别为空白对照组的 4.2倍和 2.9倍(p<0.01)。 本实验表明,壳寡糖可以增强小鼠巨噬细胞IL-lp及TNF一口的基因表 .3. 浙江大学硕士学位论文 达,使两种细胞因子基因转录及翻译水平增高,且此促基因表达作用在巨噬 细胞经IFN-Y预刺激后显著增强。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q25

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