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《浙江大学》 2003年
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康氏木霉纤维素酶的发酵及其对稻草降解利用的初探

刘小杰  
【摘要】: 纤维素是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物,同时它也是地球上数量最大的再生资源。目前,自然界中纤维素只有一小部分得到了利用,绝大多数纤维素不仅被白白浪费,而且还会造成环境污染。利用微生物生产的纤维素酶将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料,对于人类社会解决环境污染、食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。 本论文主要工作包括:纤维素酶高产菌株的选育及产酶条件的研究;康氏木霉(Trichoderma koningii)和黑曲霉(Aspergillus niger)纤维素酶发酵培养基的优化研究;β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质研究;康氏木霉和黑曲霉混菌发酵产纤维素酶的研究;纤维素酶降解稻草粉的实验研究和利用稻草粉产乙醇的初步研究。经过大量实验工作,得到了如下结果: 1)以稻草为主要碳源时,在所实验的菌种中,康氏木霉ZJ4产CMC酶和滤纸酶的活性均为最高。康氏木霉ZJ4经紫外线和硫酸二乙酯复合诱变,得到的突变株ZJ5产纤维素酶的水平明显提高。研究了其纤维素酶的产生条件:以稻草粉为碳源、(NH_4)_2SO_4为氮源、稻草与麦麸比为2:1时,康氏木霉ZJ5产酶最高。该菌株产酶最适培养温度为28℃,最适起始pH 5.0,装液量30mL,转速200r/min,当培养时间为144h时,CMC酶、滤纸酶活和β-葡萄糖苷酶活均达到最高值,分别为582.6U/mL、72.56U/mL和34.62U/mL。 2)研究了CMC酶和滤纸酶粗酶液的酶学性质,结果如下:CMC酶的最适作用温度为50℃,在40℃和50℃时热稳定性较好;滤纸酶的最适作用温度为50℃,在40℃时热稳定性较好;CMC酶的最适反应pH为4.5,在pH 2.5~pH 6.0之间较稳定;滤纸酶的最适反应pH为5.0,在pH 3.5~pH 6.0之间较稳定;Zn~(2+)、Al~(3+)、Mg~(2+)和Mn~(2+)对CMC酶酶促反应均有一定的促进作用,Mg~(2+)和Mn~(2+)对滤纸酶酶促反应有一定的促进作用。 3)稻草先粉碎到80目,再经15%醋酸预处理可以显著提高康氏木霉ZJ5发酵产纤维素酶的水平。首次利用预处理的稻草粉为主要碳源,经过正交实验,得到了 康氏木霉ZJS发酵产纤维素酶的最佳培养基组成(留L):稻草粉,33;麦鼓,20; 大麦粉,23;困H4)2504,8。 4)首次用响应面方法对康氏木霉ZJS产纤维素酶的培养基进行了优化。获得的 优化培养基组成为(g/L):稻草粉,33;麦数,15;大麦粉,15;(N H4)250;,4。 在优化培养基中发酵144h,CMC酶活、滤纸酶活和卜葡萄糖苔酶活分别达到了 765.8U/mL、155.3U/mL和39.54U/mL。 5)本研究首次将响应面分析法用于黑曲霉ZJI产p一葡萄糖普酶培养基组成的 优化,取得了较好的效果。在培养基优化前p一葡萄糖营酶活为1875U/mL,经优化 后,该酶活性达到了403 .7U/mL,显著大于优化前的水平。经响应面分析获得的优 化培养基组成为(g/L):稻草粉,6.963:麦鼓,20;大麦粉,16.5;困H4)2504, 2 .44;KHZPO4,0.5:MgSO4·7HZO,0.5。 6)利用Sephadexo一00柱和oEAE一sephadexA一50柱分离纯化了D一葡萄糖营 酶,并研究了其酶学性质和酶促反应动力学。p一葡萄糖营酶的最适作用温度为50 ℃,在40℃时热稳定性较好;日一葡萄糖营酶的最适反应pH为5.5,在pH 30一pH 8.0 之间较稳定;zn2+、川3+、ca2+和MnZ十对卜葡萄糖普酶酶促反应均有一定的促进 mg ZJZg 作用。确定了以水杨素为底物时的动力学参数:式行4.530mg/mL,蛛二0.06974 (mLmin),动力学方程为: VP 0 .06974Cs 4 .530+Cs 7)利用稻草为主要碳源,通过正交实验,得到了康氏木霉ZJS和黑曲霉 固体混菌发酵产纤维素酶的最佳培养基组成:稻草粉,6g;麦鼓,49; (N H4)2504,0.89;KHZPO4,0.059:MgSO4·7HZO,0.059;加水30mL, 大麦粉, 起始pHS.o 在优化培养基中发酵96h,CMC酶活、滤纸酶活和p一葡萄糖首酶活分别达到了 2 135U/mL、738.2U/mL不{1 1 125U/mL。 8)利用单因子实验得到了稻草粉酶解糖化的最佳条件:稻草粉先经 1.0%NaOH+1 .0%HZo:预处理,底物浓度为2.5%,糖化温度50OC,反应体系pH4.8, 滤纸酶:p一葡萄糖昔酶二1:1。运用二次通用旋转组合设计,考察了底物浓度(X,)、 酶解pH(xZ)和酶解温度(X3)对稻草粉糖化率(Y)的影响,得到了下列回归方 程: Y=0 .5744一o.o5214x一0.07一29x2+o.o443sx3一o.07929x22一。一27x32一 0 .0 1 785XIX2+0.00708lXIX3一0.05478X2X3 9)本文研究发现利用纤维素酶降解稻草粉时,稻草粉的酶解率与处理时间和酶 的浓度都有关。通过对实验数据的分析,得到了纤维素的残留量(St)和酶解量(Y) 与处理时间(t)之间的经验公式: [st]/[s。]==e一kI;[Y]/[S。]=(l一e一“) 10)本文首次利用稻草研究了糖化发酵生产乙醇的几种工艺,在糖化、发酵二 步工艺中,采用正交实验,得出了台湾酵母(5扮ccharo梢lyce:cerevisia。)利用稻草粉 水解液发酵产乙醇的最佳培养条件:起始pH为5.0、接种量巧%、培养时间48h、 培养温度为30℃;在此条件下,乙醇浓度可以达到3.105%(v/v)。在边糖化边发酵 工艺中,利用正交实验,得到了酒精酵母利用稻草粉产乙醇的最佳培养条件:起始 pH为5.0、滤纸酶:p一
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:TQ914

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