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《浙江大学》 2003年
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饲料中植物凝集素的检测方法与灭活技术研究

戴大章  
【摘要】: 本课题以植物凝集素(lectin)为研究对象,通过对大豆凝集素(SBA)和植物血细胞凝集素(PHA)的提取、测定和灭活研究以及在昆明种小鼠上的毒性实验,建立了lectin的实验室快速测定方法,探讨了lectin的热敏性及灭活方法以及lectin的对动物的影响和作用机理。 试验一研究了lectin的分离提取与纯化。采用亲和色谱法(affinity chromatography),以N-乙酰-D氨基半乳糖为亲和吸附剂,Epoxy-Sephaose为载体,N-乙酰-D氨基半乳糖-Epoxy-Sephaose为固定相,pH7.2的PBS为流动相对大豆凝集素进行分离纯化。将大豆抽提液吸附于经PBS预平衡亲和色谱柱后,先用PBS流洗至蛋白峰为基线(OD_(280nm)<0.01),然后用含0.2M半乳糖的0.9%盐水洗脱收集洗脱液,将OD_(280nm)大于0.2的各管合并、透析、冰干后即得纯化的SBA。纯化产物经pH8.9(胶浓度7.5%)聚丙烯酰胺凝胶电胶,考马斯亮篮染色,显示出一条着色深的蛋白质着色带。 试验二研究了lectin的测定方法。研究了lectin的血细胞凝集活性与其浓度的关系,探讨了试样粉碎粒度、脱脂方法、脱脂时间、抽提时间、抽提次数等测定条件对测定结果的影响。发现lectin的活力与浓度之间存在高度线性相关(R~2=0.9999)。血凝法测定饲料中lectin的含量时,其理想测定条件为,样品粉碎过40日、样品与30~60℃石油醚或乙醚比例(W/V)1:8脱脂8小时、样品与生理盐水(W/V)1:8抽提8小时。在上述条件下测定,回收率可达88%~102%。经过对8种不同的饲料及原料样品lectin含量的测定,平均相对偏差(%)为0.9~2.4,变异系数CV(%)为1.3~3.3。 葫泣J人·笋/l关·笋夕诊广 试验二测定了PHA对小鼠的L05。。以18一249体重的健康昆明种小鼠为试验动物,在 室温、清洁、笼养、白由采食条件卜,进行真胃灌注PHA,随机分组(雌雄各1,=)进行了二 次。第一次分5组,每组10只小白鼠进行真胃灌注,接毒剂量为0.5一smg/只(25~250mg/kg BW);第二次分3组,每组3只小自鼠进行真胃灌注,接毒剂最分别为10一3Omg/只(0 .5一 1.59/kgBw);第二次分3组,每组3只小白鼠进行真胃灌注,其接毒剂最分别为100~3O0mg/ 只(5~159/k 9 BW)。观察7日后,二次试验的试验组小鼠均无死亡,最高剂量达15000m留kg, 表明PHA对小鼠无急性毒性。 实验四研究了lectin的灭活方法。分别用干热、湿热、酸碱和金属离子四种方法处理人 豆植物蛋自中的人豆凝集素(S BA),探讨了理化处理对SBA活性的影响。120℃以卜的干 热处理不能使SBA的活力明显丧失:而95oC、3Omin,一00oC、20min或一05oC、一omin的 湿热处理,可使SBA的活力完全丧失。在pH 1 .0~4.5或pHg一13范围内提取人豆蛋白质, 可使SBA的活力显著丧失。人豆蛋白抽提液中三价、四价金属离子和部分二价、一价金属 离子也可显著降低SBA的活力。 综上所述,利用亲和色谱法可以获得纯度较高的lectin;采用血凝法可以较快速、简 便地测定饲料中的lectin;PHA对小鼠无致死毒性:在不影响人豆蛋自质品质的条件卜,干 热处理不能除去大豆中的SBA,适宜的湿热、酸碱和金属离子处理能有效钝化大豆中SBA 的活性。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S816

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