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《浙江大学》 2003年
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耐热木聚糖酶杂合基因的构建、表达及产物的酶学特性研究

孙建义  
【摘要】: 饲料在制粒时温度70~80℃,易造成木聚糖酶大量失活,所以提高热稳定性直接关系到其在饲料工业中的应用前景,是当前急待解决的重大难题。本研究筛选出能产木聚糖酶的微生物;克隆并在大肠杆菌中表达了木聚糖酶基因或cDNA,对产物特性进行了系统研究;在此基础上,设计、构建并表达了耐热木聚糖酶杂合基因HX,系统地评价了表达产物活性和耐热性能。主要研究结果如下: 采用RBB-木聚糖水解透明圈技术,筛选出具有木聚糖酶活性的不同微生物。单位发酵液中木聚糖酶活性由高到低依次为黑曲霉FS6(木聚糖酶ANXW)、枯草芽孢杆菌2(酶BSXW)、环状芽孢杆菌BC(酶BCXW)和褐色高温单孢菌TF(酶TfxW);对其主要生化特性研究表明,酶TfxW、BSXW、BCXW和ANXW最适反应pH分别为6.0、6.0、5.0和5.0,最适反应温度分别为70℃、60℃、50~60℃和50℃;酶BSXW、BCXW和ANXW在低温下活性较高,而TfxW在高温下酶活相对较高。 采用基因克隆技术,分别克隆了枯草芽孢杆菌2、环状芽孢杆菌BC和褐色高温单孢菌TF木聚糖酶基因以及黑曲霉FS6木聚糖酶cDNA。枯草芽孢杆菌2和环状芽孢杆菌BC木聚糖酶基因长度均为702bp,开放阅读框架(ORF)为39bp~680bp,编码213个氨基酸;褐色高温单孢菌TF木聚糖酶基因长度为1067bp,ORF为31bp~1047bp,编码338个氨基酸;黑曲霉FS6木聚糖酶cDNA长度为720bp,该序列是一个初级转录本,含有一个49bp(265bp~313bp)的内含子,外显子cDNA序列编码211个氨基酸。上述基因或cDNA与T-vector连接后,分别获得了重组克隆载体pGEM~(?)-T Easy BSX Vector、pGEM~(?)-T Easy BCX Vector、pGEM~(?)-T Easy Tfx Vector和pGEM~(?)-T Easy ANX Vector。 采用亚克隆技术,以pET-30(a)+为表达载体,在E. coli BL21中表达了枯草芽孢杆菌2和褐色高温单孢菌TF木聚糖酶基因以及黑曲霉FS6木聚糖酶cDNA,分别获得了阳性重组表达子E. coli BSX、E. coli Tfx和E. coli ANXE,其中E. coli ANXE表达产物为包涵体,经复性具有木聚糖酶活性。 分离和纯化了基因工程菌E. coli BSX和E. coli Tfx表达产物,对它们的生化特性进行了系统研究。E. coli BSX和E. coli Tfx在LB培养基中37℃下分别培养16h,单位发酵液中木聚糖酶活性分别为10.18U/ml和27.63U/ml。SDSPAGE凝胶电泳检测表明,木聚糖酶BSX分子量为20.31kDa,Tfx分子量为31.98kDa,它们均为成熟肽。BSX的最适反应温度为50~60℃,低温时酶活高于高温,40℃以下相对稳定,50℃以上酶活损失较大。Tfx的最适反应温度为70℃,低温条件下活性较低;60℃以下相对稳定,70℃以上酶存活率迅速下降。BSX的低温酶活性优于Tfx,但Tfx的耐热性能优于BSX。BSX最适反应pH为6.0, 耐热木聚糖政杂合基因的构建、表达及产物的酶学特性研究 博士学位论文 在pHS.0~7.0之间酶活性较高,pH4.0一7.0之间较为稳定;T丘的最适反应pH 为6.0,在pHS.0~7.0之间酶活性较高,pHS.0一9.0之间较为稳定。 通过对木聚糖酶BSX和T丘的成熟肤氨基酸序列同源性和二级结构单元的 分析,设计并构建了耐热杂合木聚糖酶分子,通过表达获得了耐热杂合木聚糖 酶基因工程菌E.coli HX,分离和纯化了表达产物,进而系统研究了其酶学 特性。以pGEM叱T Easy BSX Veetor为模板,SRBsX02、3RBsX01(含限制性 内切酶劝01)为引物扩增出532bp基因片断;以pGEM吼T EasyT丘Vector 为模板,5拙sxol(含限制性内切酶B田刀Hl)、3盼sx02为引物扩增出1一7bp 基因片断;以这两个基因片段为模板,SRBsX01、3RBsX01为引物,采用 基因拼接技术(SOE)构建了长度为628bp的木聚糖酶杂合基因,获得了 含杂合基因的重组质粒 poEM叱T Easy HX Veetor。将经BamHI和乃01双酶 切获得的杂合基因连接到经相同酶切的pET 30a(+)表达载体中,并导入到 E.coli BL21中表达。采用RBB一木聚糖水解透明圈技术,获得了基因工 程菌E.coli HX菌株。在LB培养基中37℃下培养16h,该基因工程菌单位 发酵液酶活性为288U/ml;与出发菌株的枯草芽抱杆菌2和褐色高温单抱 菌TF及其基因工程菌E.coli BSX和E.coli Tfx相比,酶活分别提高了3.77 倍、6.50倍、27.29倍和9.42倍。酶学特性研究表明,杂合木聚糖酶HX 分子量为27.2 kDa,最适反应温度为50一60℃;模拟饲料制粒温度,经70 ℃、80℃和90℃处理Zmin,HX存活率分别为96%、74%和48%,而亲 本木聚糖酶BSX和Tfx存活率分别为17%、9%、2%和78%、40%、12 %,与BSX和Tfx相L匕,HX分别提高了4.65倍、7.22倍、23.00倍和0.23 倍、0.85倍、3.00倍。杂合木聚糖酶HX最适反应pH为6.0一7.0;最稳 定pH为5.0一7.0。在37℃、pH6.0(模拟动物小肠生理环境)条件下, 相同酶活的HX在RBB一木聚糖平板上的水解透明圈显著大于木聚糖酶Tfx 和BSX;在pH6.o、400C保温4omin,HX使木聚糖粘度下降2 5.15%,而 BSX和Tfx分别下降9.09%和0%。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S816

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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【参考文献】
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7 史宝军;崔细鹏;王敏;鲍淑青;;木聚糖酶酶学特性及其催化功能的研究进展[A];饲料酶制剂的研究与应用[C];2009年
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【同被引文献】
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【二级引证文献】
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【相似文献】
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7 徐燕;田宝玉;施巧琴;吴松刚;黄建忠;;黑曲霉IME-216产木聚糖酶的条件优化及基因在酿酒酵母中高效表达[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2009年学术交流会论文摘要汇编[C];2009年
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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5 刘明启;提高木聚糖酶热稳定性、催化活性和结合水解纤维素能力的研究[D];浙江大学;2007年
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7 艾志录;橄榄绿链霉菌E-86木聚糖酶的固定化及低聚木糖制备研究[D];中国农业大学;2004年
8 石波;玉米芯酶法制备低聚木糖的研究[D];中国农业大学;2001年
9 国春艳;木聚糖酶和纤维素酶对后备奶牛生长代谢、瘤胃发酵及微生物区系的影响[D];中国农业科学院;2010年
10 王金全;小麦非淀粉多糖的抗营养机理及木聚糖酶在肉仔鸡小麦日粮中的应用研究[D];中国农业科学院;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王雪鹏;高产木聚糖酶芽孢杆菌的选育及产酶的研究[D];中国海洋大学;2004年
2 周晓容;肉鸡饲粮中木聚糖与木聚糖酶关系的研究[D];四川农业大学;2003年
3 黄金秀;仔猪饲粮木聚糖水平与添加木聚糖酶对养分消化率的影响[D];四川农业大学;2003年
4 王利;木聚糖酶的定向合成及其应用[D];南京林业大学;2004年
5 周秀梅;木聚糖酶生产及酶学性质的研究[D];浙江大学;2005年
6 宋敏;S-211枯草芽孢杆菌固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的研究[D];内蒙古农业大学;2011年
7 周煌凯;耐碱性短小芽孢杆菌木聚糖酶在枯草杆菌中的表达及发酵条件优化[D];西北农林科技大学;2010年
8 廖超登;S7-xyn木聚糖酶的酶学性质及其在麦草浆漂白中的应用[D];华南理工大学;2010年
9 李运峰;末端氨基酸残基去除对黑曲霉木聚糖酶XynⅢ热稳定性影响[D];河南农业大学;2010年
10 张红莲;橄榄绿链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1所产木聚糖酶的纯化、酶基因的克隆及表达[D];中国农业科学院;2002年
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