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耐热木聚糖酶杂合基因的构建、表达及产物的酶学特性研究

孙建义  
【摘要】: 饲料在制粒时温度70~80℃,易造成木聚糖酶大量失活,所以提高热稳定性直接关系到其在饲料工业中的应用前景,是当前急待解决的重大难题。本研究筛选出能产木聚糖酶的微生物;克隆并在大肠杆菌中表达了木聚糖酶基因或cDNA,对产物特性进行了系统研究;在此基础上,设计、构建并表达了耐热木聚糖酶杂合基因HX,系统地评价了表达产物活性和耐热性能。主要研究结果如下: 采用RBB-木聚糖水解透明圈技术,筛选出具有木聚糖酶活性的不同微生物。单位发酵液中木聚糖酶活性由高到低依次为黑曲霉FS6(木聚糖酶ANXW)、枯草芽孢杆菌2(酶BSXW)、环状芽孢杆菌BC(酶BCXW)和褐色高温单孢菌TF(酶TfxW);对其主要生化特性研究表明,酶TfxW、BSXW、BCXW和ANXW最适反应pH分别为6.0、6.0、5.0和5.0,最适反应温度分别为70℃、60℃、50~60℃和50℃;酶BSXW、BCXW和ANXW在低温下活性较高,而TfxW在高温下酶活相对较高。 采用基因克隆技术,分别克隆了枯草芽孢杆菌2、环状芽孢杆菌BC和褐色高温单孢菌TF木聚糖酶基因以及黑曲霉FS6木聚糖酶cDNA。枯草芽孢杆菌2和环状芽孢杆菌BC木聚糖酶基因长度均为702bp,开放阅读框架(ORF)为39bp~680bp,编码213个氨基酸;褐色高温单孢菌TF木聚糖酶基因长度为1067bp,ORF为31bp~1047bp,编码338个氨基酸;黑曲霉FS6木聚糖酶cDNA长度为720bp,该序列是一个初级转录本,含有一个49bp(265bp~313bp)的内含子,外显子cDNA序列编码211个氨基酸。上述基因或cDNA与T-vector连接后,分别获得了重组克隆载体pGEM~(?)-T Easy BSX Vector、pGEM~(?)-T Easy BCX Vector、pGEM~(?)-T Easy Tfx Vector和pGEM~(?)-T Easy ANX Vector。 采用亚克隆技术,以pET-30(a)+为表达载体,在E. coli BL21中表达了枯草芽孢杆菌2和褐色高温单孢菌TF木聚糖酶基因以及黑曲霉FS6木聚糖酶cDNA,分别获得了阳性重组表达子E. coli BSX、E. coli Tfx和E. coli ANXE,其中E. coli ANXE表达产物为包涵体,经复性具有木聚糖酶活性。 分离和纯化了基因工程菌E. coli BSX和E. coli Tfx表达产物,对它们的生化特性进行了系统研究。E. coli BSX和E. coli Tfx在LB培养基中37℃下分别培养16h,单位发酵液中木聚糖酶活性分别为10.18U/ml和27.63U/ml。SDSPAGE凝胶电泳检测表明,木聚糖酶BSX分子量为20.31kDa,Tfx分子量为31.98kDa,它们均为成熟肽。BSX的最适反应温度为50~60℃,低温时酶活高于高温,40℃以下相对稳定,50℃以上酶活损失较大。Tfx的最适反应温度为70℃,低温条件下活性较低;60℃以下相对稳定,70℃以上酶存活率迅速下降。BSX的低温酶活性优于Tfx,但Tfx的耐热性能优于BSX。BSX最适反应pH为6.0, 耐热木聚糖政杂合基因的构建、表达及产物的酶学特性研究 博士学位论文 在pHS.0~7.0之间酶活性较高,pH4.0一7.0之间较为稳定;T丘的最适反应pH 为6.0,在pHS.0~7.0之间酶活性较高,pHS.0一9.0之间较为稳定。 通过对木聚糖酶BSX和T丘的成熟肤氨基酸序列同源性和二级结构单元的 分析,设计并构建了耐热杂合木聚糖酶分子,通过表达获得了耐热杂合木聚糖 酶基因工程菌E.coli HX,分离和纯化了表达产物,进而系统研究了其酶学 特性。以pGEM叱T Easy BSX Veetor为模板,SRBsX02、3RBsX01(含限制性 内切酶劝01)为引物扩增出532bp基因片断;以pGEM吼T EasyT丘Vector 为模板,5拙sxol(含限制性内切酶B田刀Hl)、3盼sx02为引物扩增出1一7bp 基因片断;以这两个基因片段为模板,SRBsX01、3RBsX01为引物,采用 基因拼接技术(SOE)构建了长度为628bp的木聚糖酶杂合基因,获得了 含杂合基因的重组质粒 poEM叱T Easy HX Veetor。将经BamHI和乃01双酶 切获得的杂合基因连接到经相同酶切的pET 30a(+)表达载体中,并导入到 E.coli BL21中表达。采用RBB一木聚糖水解透明圈技术,获得了基因工 程菌E.coli HX菌株。在LB培养基中37℃下培养16h,该基因工程菌单位 发酵液酶活性为288U/ml;与出发菌株的枯草芽抱杆菌2和褐色高温单抱 菌TF及其基因工程菌E.coli BSX和E.coli Tfx相比,酶活分别提高了3.77 倍、6.50倍、27.29倍和9.42倍。酶学特性研究表明,杂合木聚糖酶HX 分子量为27.2 kDa,最适反应温度为50一60℃;模拟饲料制粒温度,经70 ℃、80℃和90℃处理Zmin,HX存活率分别为96%、74%和48%,而亲 本木聚糖酶BSX和Tfx存活率分别为17%、9%、2%和78%、40%、12 %,与BSX和Tfx相L匕,HX分别提高了4.65倍、7.22倍、23.00倍和0.23 倍、0.85倍、3.00倍。杂合木聚糖酶HX最适反应pH为6.0一7.0;最稳 定pH为5.0一7.0。在37℃、pH6.0(模拟动物小肠生理环境)条件下, 相同酶活的HX在RBB一木聚糖平板上的水解透明圈显著大于木聚糖酶Tfx 和BSX;在pH6.o、400C保温4omin,HX使木聚糖粘度下降2 5.15%,而 BSX和Tfx分别下降9.09%和0%。


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