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《浙江大学》 2003年
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黄瓜离体子叶节花分化的生理和分子基础研究

王利琳  
【摘要】: 关于成花机理的研究一直是植物发育生物学中的热点问题,也是生物学中的一个基本理论问题。成花过程包括花的诱导、花原基与花器官原基的形成以及花器官的发育等阶段,本文研究的重点是花原基与花器官原基的分化形成。本实验以黄瓜为材料,开展了黄瓜子叶离体培养物直接成花实验系统的建立和优化、成花的形态变化时程、成花的生理生化变化、运用RNA原位杂交技术分析CFL基因在花芽分化中的时空表达以及开花基因工程等方面的研究。主要研究结果如下: 1.试验了在不同pH值培养基上连续培养和预培养对离体黄瓜子叶直接形成花芽的影响。连续培养时,以pH6.5时花芽形成百分率最高,为55.0%;pH预培养时,以pH7.0预培养2d的效果最好,花芽分化率可达71.4%,并使花芽形成高峰期提前20d左右。 通过切去1/2子叶和不同长度下胚轴、调节培养基中激素配比及浓度、采用子叶节培养等进一步的试验发现,三碘苯甲酸(TIBA)和多效唑(PP333)极显著地协同促进完全切除下胚轴的黄瓜离体子叶节直接成花,TIBA与PP333相配合的最适浓度为1.0~1.5mg/L,直接成花率高达90%。这一实验系统操作简单、周期短、成花率高、重复性好,为后续研究奠定了基础。 2.对黄瓜0~7d幼苗及去顶后在诱花和诱芽培养基上培养0~8d的子叶节进行了系统的石蜡切片观察,未发现0~7d幼苗的子叶叶腋存在明显的潜伏芽。去顶后1~2d在子叶叶柄基部与切口之间的表皮下细胞分裂形成突起,去顶后6d诱花与诱芽的突起表现出形态差异,诱花子叶节突起的上端变钝,而诱芽子叶节突起的上端成尖锥状。去顶后8d诱花子叶节分化形成完整的花芽。扫描电镜观察证实,去顶后3d可见原基突起,4d原基出现二次突起,6d时即可区分出花芽和营养芽之间的形态差异。通过上述观察,明确了黄瓜子叶节花芽分化的形态时程。 3.通过在有Ca~(2+)和无Ca~(2+)培养基上进行转换试验,发现黄瓜子叶节离体培 浙江大学博士学位论文 中文摘要 养物花分化过程中存在C扩+敏感期。子叶节在无C扩+培养基中分别培养。、1、2、 3、4、5、6d后,转入含6llun。比CaC12的培养基中培养24h,再转回到无c扩干 培养基继续培养。结果表明在无caz+培养基中培养冬3d后,进行24 h Caz+脉冲 处理显著增加子叶节的花芽分化率,其中以无C扩+培养4d后C扩+脉冲处理的效 果最为明显,花芽分化率达34.3%。认为黄瓜子叶节离体培养O碑d是花分化的 c扩+作用敏感期。 用高效液相色谱法(HPLC)测定了黄瓜子叶节花芽分化期(0一6d)内源激 素及多胺的变化。结果显示,子叶培养O一Zd生长素(IAA)、赤霉素(GA3)、 玉米素(ZT)、脱落酸(ABA)等4种内源激素均明显下降,4一sd略有上升, 表明O~2 d IAA、G与和ABA的剧降有利于花原基形成,3一sd较高的ZT含量 有利于花器官原基的形成。除腐胺(Put)外,精胺(Spm)、亚精胺(spd)、尸 胺(Cad)在O一ld均下降,1碎d上升,4一sd再下降,Put在0-ld急剧上升, 而后持续下降,表明高水平的内源多胺总量和Put可能有利于花原基分化,Zd 后Spm含量上升有利于花器官原基分化,而Cad含量变化可能是区别花芽和营 养芽分化的特征之一。 4.首次利用RNA原位杂交技术,研究了LFY同源基因—C万艺基因在黄 瓜花芽分化和营养芽分化及形成中的表达模式。结果显示:去顶培养3d后,CF艺 基因首先表达于原基顶端;4d后表达增强,表达范围扩展到原基中心区域:sd 一6d,CF’L基因强表达于整个花原基、花器官原基或叶原基;7d后,CF’L基因 仅表达于花瓣和雄蕊,或叶腋原基和最幼嫩叶原基,表达强度也减弱:在成熟组 织中没有检测到CF艺基因的表达。结果说明CF艺基因在黄瓜营养性分生组织、 叶原基、花分生组织和花器官原基形成之初发挥重要作用,在花原基和花器官原 基形成时表达最强;仅靠CF艺基因的杂交信号不能确认原位组织具有花属性, 但是,花分生组织属性的获得、花器官原基的启动确实需要有CFL基因的表达。 5.通过基因工程方法将C万Z基因异源导入大岩桐,期望得到提早开花的转 基因新品种,为控制重要的粮食作物和名贵花卉的开花时间提供实验依据,国内 外还不多见。利用pBC KS十质粒载体上的Smal和Sacl酶切位点,将CFz 基因成功克隆到表达载体pBI 1 21(含CaMv35S启动子)上,命名为pBI一cfl。 通过根癌农杆菌 EHA105介导,叶盘法转化大岩桐,经过抗性压力筛选、诱 浙江大学博士学位论文 中文摘要 导分化后,共获得45株再生植株。经过PCR检测、DNA点杂交和PCR一 Southern杂交表明,目的基因已经整合到大岩桐基因组中。目前,对转CFL 基因再生植株的Northern杂交、开花性状表现、生理生化分析和后代遗传行 为的观察和研究正在进行之中。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S642.2

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