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《浙江大学》 2003年
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大熊猫等濒危动物FSH/LH和GH/GHR基因的克隆及其表达研究

廖鸣娟  
【摘要】: 野生动物是自然生态环境的重要组成部分,保护野生动物尤其是拯救濒危野生动物,对维持地球生态平衡和保持生物多样性具有重要意义。圈养人工繁殖,是移地保护濒危动物,增加动物种群数量的重要手段之一。但在圈养条件下,多数濒危动物繁殖率都较低,严重阻碍移地保护的进程。特别是大熊猫,其生殖能力和育幼能力高度特化,生殖率和幼仔存活率低已成为目前圈养繁殖面临的两大急待解决的问题。研究表明生殖率低与生殖轴系中的各种激素内分泌失调,尤其是促性腺激素(FSH和LH)分泌不足有关。幼仔存活率低则与出生幼仔先天发育不全,免疫系统发育尚不完善相关。至今关于大熊猫生殖力和幼仔存活率低的分子基础仍不清楚。因此,本研究针对以大熊猫为主的濒危动物繁殖率低的两大主要问题,以大熊猫、小熊猫和东北虎为研究对象,开展了在动物生长发育和生殖过程中发挥重要作用的促性腺激素(FSH/LH)、生长激素及其受体(GH/GHR)的基因克隆、序列分析和表达研究,并探讨了今后生物工程生产大熊猫等濒危动物FSH/LH和GH用于人工繁殖实践的意义和可能性。主要结果如下: 1.利用RT-PCR技术从垂体组织扩增出大熊猫促性腺激素α、FSHβ和LHβ亚基编码区序列,它们分别编码120、129和141氨基酸的前体蛋白质,预测的分子量分别为13.6kD,14.6kD和15kD。同源性分析表明三个亚基的核苷酸和氨基酸序列与已报道的人、猪、牛、鼠和羊的序列高度同源(>74%)。对位比较发现大熊猫序列也具有明显的氨基酸特异性,这些氨基酸是否会影响大熊猫FSH及LH的分子构型进而影响其功能、或最终引起大熊猫促性腺激素的分泌障碍则有待进一步的研究。 2.将构建的真核表达载体pcDNA/α分别与pcDNA/FSHβ和pcDNA/LHβ共转染COS7细胞,进行瞬时表达。RT-PCR检测,表明三个亚基基因在COS7细胞中得到正常转录。体外生物学活性分析表明,表达的FSH和LH的培养液能有效刺激大鼠睾丸Sertoli和Leydig’s细胞产生雌二醇和睾酮,证实COS7表达的FSH和LH已被正确地装配和糖基化修饰,能从COS7细胞有效分泌,且具有天然FSH和LH相似的生物学活性。此结果为将来利用CHO细胞稳定表达获得大熊猫重组FSH和LH,并将它们应用于大熊猫人工繁殖的深入研究奠定基础。 3.构建大熊猫α,FSHβ和LHβ亚基基因的原核表达载体pGEX-α,pGEX-FSHβ和pGEX-LHβ,IPTG诱导后在BL21宿主菌中得到高效融合表达,表达的融合蛋白GST-α,GST-FSHβ和GST-LHβ的分子量分别约为36kD、38kD和41kD,并以不溶的包涵体形式存在于细胞中。无法直接用谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析柱纯化。为了在变性条件下亲和层析纯化表达蛋白,本 浙江大学博士学位论文 试验分别SM尿素和o.IM NaOH为溶剂,对溶解融合蛋白的条件进行了优化。结果发现尿 素溶解的融合蛋白不能进一步纯化,而0.IM NaoH溶解的蛋白能得到一定程度的纯化。表 明经0.IMNaoH溶解的融合蛋白能重折叠,从而能与层析柱上琼脂糖树脂结合而得到纯化, 为进一步研究打下基础。 4.克隆并测序小熊猫Q和LHp亚基的编码区序列,相似于大熊猫序列,它们也编码120 和141个氨基酸的前体蛋白,预测的分子量分别为13.skD和巧.IkD,两种动物LH序列的 同源性达到95%以上。根据小熊猫、大熊猫与其它10种代表性哺乳动物的序列构建的分子 进化树,与传统的物种分类地位基本吻合;但a亚基基因分析表明,小熊猫和后兽亚纲分枝 具有基因同源性与物种分类地位极不相符现象,推测哺乳动物尤其是后兽亚纲有袋类Q亚基 的进化速度十分缓慢,其序列可能与哺乳动物的祖先Q亚基基因非常接近。本试验绘制的进 化树也不支持“小熊猫与大熊猫归于同一科”的观点,从而为解决大、小熊猫的分类地位问 题提供了又一分子生物学依据。 5.与多数哺乳类动物相似,克隆的东北虎。、FsHp亚基的开放阅读框为363bp和393bp, 编码120和129个氨基酸的蛋白,分子量为13.5山和14.7山。但LH旦亚基序列具明显特 异性,编码142个氨基酸的前体蛋白,在信号肤部分比其它物种多一个Leu,其预测分子量 为巧.1叨。在核昔酸和氨基酸水平,东北虎三个亚基序列与其它物种相应序列也具有较高 的同源性(64.7一96.6%)。 6.FSH和LH在畜牧业生产中被广泛用于促发情和排卵,目前己在大熊猫、东北虎等濒危 动物人工繁殖中得到试用,但是效果普遍较差,其原因不甚清楚,可能与所用异源激素的异 质性有关,使用高同源性激素可能会产生更好的效果。本试验比较了克隆的大熊猫、东北虎 及小熊猫FSH或LH亚基与人、鼠、羊、牛和猪哺乳动物相应序列,发现三个物种序列都与 猪的序列具有最高的同源性,提示猪促性腺激素可能是大熊猫、东北虎和小熊猫人工繁殖研 究应用中外源性异种激素的最佳选择。 7.克隆和分析了进化上较保守,并在生长发育、生殖和免疫调节中发挥重要作用的大熊猫 GH栩届H)和GHR伽届HR)基因。结果显示,月届H cDNA编码26氨基酸的信号肤和190氨基酸 的成熟肤。月届HR则编码638氨基酸的前体蛋白,由18氨基酸信号肤和620氨基酸成熟肤 组成。同源性比较发现,大熊猫GH和GHR的核昔酸和氨基酸序列,与己报道哺乳动物相应 序
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q785

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【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 耿文鑫;抗绝经后骨质疏松蛋白疫苗的实验研究[D];西北大学;2013年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 马文祥,刘国世;猞猁GH基因部分序列及其5′端调控区的克隆与分析[J];东北林业大学学报;2001年05期
2 杨灿锋,杨利国;抑制素的功能与作用机理探讨[J];动物医学进展;2002年01期
3 胡锦矗;;小熊猫的繁殖生物学研究[J];四川师范学院学报(自然科学版);1991年01期
4 周荣家,程汉华,余其兴,张亚平;大熊猫Sox和Zfx基因[J];中国科学C辑:生命科学;1998年06期
5 陈大元,孙青原,刘冀珑,李光鹏,廉莉,王敏康,韩之明,宋祥芬,李劲松,孙强,陈玉村,张亚平,丁波;大熊猫供核体细胞在兔卵胞质中可去分化而支持早期重构胚发育[J];中国科学C辑:生命科学;1999年03期
6 郝建明,刘平,张平,陈实平,王莎丽,阎月敏,董红燕,陈克铨;黄体生成素和卵泡刺激素在大鼠垂体前叶的细胞共定位研究[J];解剖学报;1997年01期
7 黄炎;小熊猫的饲养管理[J];四川动物;2000年04期
8 汤纯香,张和民;圈养繁殖在大熊猫保护生物学中的作用[J];四川动物;2001年02期
9 黄炎,张贵权,张和民;圈养大熊猫的繁殖特性和生命表[J];四川动物;2001年02期
10 冯文和 ,叶志勇,何光昕,张安居;大熊猫生育能力的研究[J];四川大学学报(自然科学版);1984年03期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 施健健;周红霞;张红琳;;抑制素基因免疫京白鸡后在卵巢组织中的表达[J];安徽农学通报(上半月刊);2009年13期
2 孙志宏;邱瑞;李延清;周茂林;;哺乳动物核移植研究[J];安徽农业科学;2008年07期
3 廖清华;赵广伟;何若钢;潘天彪;李孟军;赵彦玲;;动物异种核移植的研究进展[J];安徽农业科学;2008年30期
4 杨思林;刘宁;李纯;;繁殖期笼养孟加拉雌虎白昼行为的时间分配研究[J];安徽农业科学;2011年32期
5 田明宇;崔凯;马泽芳;梁玉颖;李延鹏;高善颂;牛树田;王海涛;梁俊文;杨淑慧;;发情期蓝狐卵泡发育的显微结构观察[J];安徽农业科学;2011年33期
6 张运海,章孝荣,刘亚,金仁桃,琚书存,章美玲,汪存利;波尔山羊及黄牛耳部成纤维细胞的体外培养[J];安徽农业大学学报;2002年04期
7 陈大元,赵学坤,陈林,冯文和,叶志勇;大熊猫卵巢的滤泡闭锁和囊肿的研究[J];动物学报;1988年03期
8 杨晓娟,杨玉华,张义正,陈红卫,费立松,宋云芳,何光昕;浣熊SRY-HMG box的克隆和序列分析[J];动物学报;2002年03期
9 廖鸣娟,朱睦元,叶丹,张志和,张安居,沈富军;东北虎促卵泡激素和促黄体激素基因的克隆及其序列分析[J];动物学报;2002年06期
10 郑济芳,朱睦元;扬子鳄的CaSox4基因的分子克隆和进化分析[J];动物学报;2003年03期
中国重要会议论文全文数据库 前5条
1 严泉剑;李六金;;核移植的现在和未来[A];中国实验动物学会青年科技协会第二届学术研讨会论文汇编[C];2001年
2 罗军;武永厚;刘长国;刘文;;绵羊、山羊生长激素基因研究进展(英文)[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
3 辛晓玲;徐照学;金仁桃;程立子;李彬;;以兔卵母细胞为核受体的牛体细胞克隆[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
4 李彦欣;李宁;;哺乳动物种克隆的研究进展[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
5 蒋志刚;李春旺;曾岩;;中国野生动物研究进展[A];中国生物多样性保护与研究进展——第五届全国生物多样性保护与持续利用研讨会论文集[C];2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王琳;Ghrelin对大鼠下丘脑—垂体—性腺的影响及其机理研究[D];安徽农业大学;2010年
2 曹志红;老虎与人:中国虎地理分布和历史变迁的人文影响因素研究[D];陕西师范大学;2010年
3 赵高平;马体细胞核移植的研究[D];内蒙古农业大学;2011年
4 何丽;川金丝猴(Rhinopithecus roxellana)遗传学与栖息地分析[D];石河子大学;2010年
5 朱化彬;奶牛体外胚胎生产技术的研究[D];甘肃农业大学;2011年
6 包慧君;中华鳖肠道、脾脏和脑垂体的主要功能细胞学研究[D];南京农业大学;2010年
7 郭继彤;成年体细胞克隆山羊研究[D];西北农林科技大学;2000年
8 徐艳春;虎(Panthera tigris)微卫星位点多态性及其在圈养种群管理中的应用[D];东北林业大学;2001年
9 徐营;兔卵胞质为受体的异种核移植研究[D];南京农业大学;2002年
10 潘求真;利用体细胞核移植技术生产转基因山羊的研究[D];东北农业大学;2002年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘晓东;山羊发情周期中卵巢内FSHR的定位及其mRNA表达规律的研究[D];山东农业大学;2010年
2 侯盟;GIS在甘肃白水江国家级保护区多目标物种保护中的应用[D];北京林业大学;2011年
3 费冬波;湖南莽山国家级自然保护区宜章臭蛙与花臭蛙繁殖期的生境选择与种群动态研究[D];中南林业科技大学;2010年
4 王丽;沂蒙黑山羊性周期中GTH受体在输卵管的分布及其mRNA表达规律的研究[D];山东农业大学;2011年
5 苏广华;藏羚羊异种动物克隆研究[D];内蒙古大学;2011年
6 薛超;转RNA干涉Myostatin基因小鼠成纤维细胞的筛选[D];东北林业大学;2011年
7 王贺;延边奶山羊—绵羊体细胞克隆胚融合、激活条件的研究[D];延边大学;2011年
8 吕颜枝;雌激素受体在山羊腺垂体生殖激素分泌细胞中的分布[D];西北农林科技大学;2011年
9 秦祖兴;食蟹猴—猪异种体细胞核移植体系的建立[D];广西大学;2011年
10 温兵强;Scriptaid和咖啡因对绵羊体细胞核移植效果的影响研究[D];河北农业大学;2012年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 赵三军;陈吉华;王辉;;改良丽春红三色法在牙本质粘结界面染色中的应用研究[J];口腔颌面修复学杂志;2009年06期
2 吕荣;改进的丽春红三色法[J];陕西新医药;1986年08期
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 刘琼;草鱼促性腺激素基因原核表达及多克隆抗体的制备[D];湖南师范大学;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 童第周,叶毓芬,陆德裕,童夙明,杜淼;鱼类不同亚科间的细胞核移植[J];动物学报;1973年03期
2 裴文中;大熊猫发展简史[J];动物学报;1974年02期
3 王将克;关于大熊猫种的划分、地史分布及其演化历史的探讨[J];动物学报;1974年02期
4 朱靖,龙志;大熊猫的兴衰[J];动物学报;1983年01期
5 陈大元,赵学坤,陈林,冯文和,叶志勇;大熊猫卵巢的滤泡闭锁和囊肿的研究[J];动物学报;1988年03期
6 陈大元,石其贤,宋祥芬,赵学坤,段崇文,何光昕,叶志勇,张安居,冯文和;大熊猫与金黄地鼠体外异种受精的研究[J];动物学报;1989年04期
7 魏辅文,冯祚建,王祖望;相岭山系大熊猫和小熊猫对生境的选择[J];动物学报;1999年01期
8 冯文和,叶志勇,何光昕,张安居;大熊猫雌性生殖器官的解剖和组织学观察[J];动物学研究;1984年02期
9 胡刚;高黎贡山小熊猫生态对策的初步研究[J];动物学研究;1998年05期
10 潘文石;;走向历史舞台的尽头[J];大自然;1982年02期
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