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《浙江大学》 2003年
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扬子鳄(Alligator sinensis)和中华鳖(Trionyx sinensis)的Sox基因研究

郑济芳  
【摘要】: Sox基因均含有一个编码高速泳动蛋白(High-Mobility-Group,HMG)的盒区,其对应的氨基酸组成与位于哺乳动物Y染色体上的SRY基因的HMG盒区相比,至少有50%的同源性。据不完全统计,目前已从包括哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类以及果蝇等不同物种中克隆了150多个Sox基因。Sox基因家族分成7个亚族(A,SRY;B,Sox-1,-2,-3,-14,-21;C,Sox-4,-11,-12,-22,-24;D,Sox-5,-6,-13,-23;E,Sox-8,-9,-10;F,Sox-7,-17,-18;G,Sox-15,-16,-20),其中,除了Sox3和SRY基因分别位于哺乳动物的X和Y染色体上,其他Sox基因均位于常染色体上。哺乳动物Sox3基因被认为是睾丸决定基因SRY的起源基因。Sox3、Sox9等其它Sox基因也可能与脊椎动物的性别决定和分化有关。然而,对于温度决定型性别决定的分子机理至今仍不清楚。 本研究以性别决定方式为温度决定型(Temperature-dependent sex determination,TSD)的扬子鳄(Alligator sinensis)和中华鳖(Trionyx sinensis)为实验对象,采用兼并引物PCR,从扬子鳄和中华鳖的基因组DNA中分别克隆并测序8个和7个HMG盒区,每个盒区长度均为216bp。扬子鳄的8个HMG盒区命名为AS41~48基因,中华鳖的7个HMG盒区命名为TS41~47基因。8个AS基因组成3组(Class),7个TS基因也组成3组,但AS与TS之间没有互相重叠。同源序列比较表明:AS43~46和TS43~46与鼠Sox12的HMG盒区有95%的氨基酸同源性,表明是鼠Sox12的同源基因(homologues):AS47~AS48与鼠Sox4的HMG盒区分别有100%和97%的氨基酸同源性,可以认为AS47~48是鼠Sox4的同源基因;与鼠、鸟Sox21的HMG盒区相比,TS47分别有98%和100%的氨基酸同源性。分析结果表明:AS47和TS47是直向同源基因(orthologues)。 与鼠的Sox1、Sox2或Sox3的HMG盒区相比,AS41、AS42、TS41、TS42分别有81%、79%、80%、72%的氨基酸同源性,表明AS41~42和TS41~42是鼠Sox-1、-2、-3的同源基因。进一步序列分析表明:AS41~42、TS41~42与非爬行类脊椎动物的Sox-1、-2、-3的氨基酸同源性低于非爬行类脊椎动物包括哺乳 类、鸟类、两栖类和鱼类的肠工一1、一2、一3相互之间的氨基酸同源性,。分子系统 发生分析表明AS41~42和Z弘1碑2的成簇(Cluster)偏离非爬行类脊椎动物肋工一1、 一2、一3同源基因之间的成簇,显示了AS41~42和了万碑1一2在物种内的特异性进 化,并且序列变化一定发生在羊膜动物多样化之后。本研究首次在爬行动物中克 隆了哺乳动物辜丸决定基因(SR力的起源基因(加力)的同源序列,有助于进一步 研究5’Ox基因与温度决定型性别决定的关系。 为了克隆到与胚胎发育有关的新基因,以孵化一星期的中华鳖(Trto尸砂优 sinensis)胚胎的头部、生殖晴混合组织为原始材料,采用SMART但witching 丛eehanism丛5’end of旦NA Iranseript)和长距离PCR伍D一PCR)技术,构建T一 个中华鳖cDNA表达文库。分析结果表明,该未扩增的cDNA文库大约含有4.134 xlo,个克隆。任意挑取了192个克隆,提取质粒后用助I酶切鉴定表明:没有 插入片段的克隆为9个,插入了CDNA片段的克隆为183个,插入的。DNA片段 大小范围为0.4一3.skb。其中,插入片段在0.4一1.0 kb之间的克隆为19个,在 1.1一2.okb之间的克隆为53个,在2.1一3.okb之间的克隆为92个,大于3.Ikb的 克隆为19个。 从插入片段在2.1一3.Okb之间的克隆中,任意挑选12个克隆,提取质粒后, 从5’端进行测序,序列分析表明:12个序列均有开放阅读框(旦pen一:eading丘ame, oRF)的第一个密码子(ATG),没有内含子。Poly(A)信号序列伍AUAAA)也在 招月晒因D中被证实。Blast分析表明,12个序列代表5种类型的基因:核糖体蛋 白基因(ts RpL4,tsRp丈6,招天尸乙26)、组织特异性表达的基因(钻尸乃从招月叨火D)、线粒 体基因(tsC“叨、结构蛋白基因伽DC从括人从石,,ts刀一ctin)、编码转录因子的基 因(招月沏吟1,tsDA尸5)。其中,招月沏吟1、招刀CN、仃尺尸乙26、招材从护和招刃只PS基 因在爬行动物中为首次克隆。该发育阶段特异性cDNA文库可以进一步用于中 华鳖胚胎发育过程中相关基因的鉴定分离、结构功能分析、以及表达调控机制研 究。 采用”GW一pCR区andom助med少ne里alki飞pCR)方法,从经及。天I消化 过的中华鳖(Trio矛移优sinensis)基因组DNA中克隆了c眨治xZ基因(72ObP),它与 鼠、鸟的及戏2基因分别有85%和91%的核昔酸同源性,93%和97%的氨基酸同 源性。进一步分析表明,已巴滩2编码的238个氨基酸多肤链含有两个保守的功 能区域:位于N端的HMG盒区(1一78aa)和位于C端的转录激活区(131一236aa), 以及一个保守的特征性B亚族同源区域(79一90aa)与HMG盒区的C端相连。高 度的序列同源性和结构相似性表明C泛治戈2是中华鳖的直向同源基因。肠工2基因 在哺乳类、鸟类、爬行类以及两栖类中极端保守,说明sbxZ功能在进化中可能 也是非常保守的。C心以2基因的HMG盒区外的序列信息可以进一步研究它的功 育旨。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q953

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