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《浙江大学》 2003年
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大熊猫和朱鹮神经营养因子基因家族的克隆、表达及活性鉴定

饶刚  
【摘要】: 大熊猫和朱鹮是世界濒危野生兽类及鸟类的旗舰物种。多年来,由于猎杀和栖息地遭到严重破坏等原因,种群已濒临灭绝的边缘。为了拯救此二物种,我国政府主管部门相继制定了人工易地保护的物种保护策略,以期通过人工圈养条件下的自然繁殖和人工繁殖,达到增加种群的数量,促进野生种群恢复之目的。然而,在大熊猫种群中,癫痫的发病率占其总发病率的8%左右,且有3/4的患者为成年及老年雄兽,因此,多年来癫痫病已成为大熊猫非正常死亡的主要疾病之一。与此同时,在朱鹮的圈养种群中,由视神经病变导致的先天性弱视患者的发病率达到了3~5%,此类疾病已严重地威胁着朱鹮的生存。由于癫痫和视神经病变类疾病均属于遗传性疾病,因此,利用分子生物学技术,对因癫痫和遗传性弱视症导致的神经元损伤具有保护及再生作用,以及视神经通路的发育、分化和受损视觉通路具有修复作用的相关基因,开展克隆、表达和活性鉴定之研究,将为通过基因工程技术实现其疾病治疗之目标奠定基础。这对于促进大熊猫和朱鹮圈养种群之现有疾病治疗体系层次的提高,改善种群现有的健康状况,具有重要的理论意义和实用价值。 神经营养因子(Neurotrophic factors,NTFs)是一类由神经元、神经支配的靶组织或胶质细胞产生的能促进中枢和外周神经分化、生长和存活的活性蛋白质。该蛋白在神经系统的发育和正常生理功能的维持等方面起着重要作用。目前,已知的神经营养因子有三个家族:神经生长因子(Neurotrophins,NTs)家族、胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)家族和睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor,CNTF)家族。研究表明,神经营养因子对癫痫造成的神经元损伤具有保护及再生作用,而对于视神经通路的发育和分化,以及受损视觉通路的修复也 饶刚:大熊独和朱赐神经营养因子基因家族的克隆、表达及活性鉴定 起到关键作用。 本论文经引物设计与合成后,利用PCR技术分别自大熊猫和朱 鹤的基因组中克隆了GDNF基因和NTs基因家族各成员成熟肽的完 整编码序列。通过序列分析发现,这些基因在进化上是保守的。继 后,将各成熟肽完整编码序列克隆至pGEX—4T—3表达载体,并经 IPTG 诱导进行原核生物表达,获得了大熊猫神经生长因子(NGF) 和神经营养素4(NT-4),以及朱鹤脑源性神经营养因子(BDNF) 及此二动物GDNF的重组表达蛋白。利用SDS-PAGE、GST酶活性 及Western 杂交等技术初步证明了所获得的重组表达蛋白为GDNF 基因和NTS基因家族各成员之编码蛋白。最后,对重组表达蛋白经 Glutathlone Sepharose 4B Microspin Column亲和纯化后,进行大鼠 肾上腺嗜铬瘤细胞 (P 2)神经营养因子的活性鉴定,发现其能够诱 导神经细胞分化产生突触,即具有预期的生物学活性,表明所获表 达蛋白为大熊猫NT.4及朱鹦BDNF基因所表达的重组蛋白质。 目前,虽然对人之癫痛与视神经病变类疾病的基因治疗尚处于 探索阶段,而动物在此领域的工作尚未起步,但本文所完成的大熊 猫和朱鹤神经营养因子(NTFs)基因家族的克隆、表达及活性鉴定工作, 无疑为后续的深入研究奠定了基础。 此外,利用神经生长因子NT-3及NT.4基因的保守性,结合线 粒体DNA上的序列和其它传统分类学资料,对大熊猫及小熊猫的分 类地位进行了探讨,认为应将小熊猫单独列为一科,大熊猫与小熊 猫关系较远,应划入熊科。
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