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《浙江大学》 2003年
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口蹄疫病毒VP1抗原基因在模式植物叶绿体中的重组和表达

孙萌  
【摘要】: 口蹄疫是当今世界危害最严重的家畜传染病之一。研究可用于预防口蹄疫病毒疫苗,是预防口蹄疫的主要方式。而传统的灭活疫苗和弱毒疫苗由于其潜在的危险性,使其应用受到很大的限制。目前研究人员通过基因工程方法开发口蹄疫安全的新型疫苗成为研究的热点。 口蹄疫病毒的主要抗原组分为VP1结构蛋白,它能够诱导机体产生保护性的抗体反应。最近利用转基因植物表达的口蹄疫病毒VP1蛋白注射和饲喂小鼠后,能够诱导其体内产生特异性中和抗体,并使小鼠得到有效的免疫保护。另外利用转基因植物表达口蹄疫病毒VP1抗原蛋白具有安全廉价、蛋白折叠充分、免疫原性良好等特点。同时植物细胞还是一种理想的口服疫苗保护载体,在其中表达的抗原蛋白甚至无须纯化,可以直接口服免疫。但是抗原蛋白在植物生物反应器中的表达量较低(占植物中可溶性蛋白的0.01%~0.37%)限制了其进一步的开发利用。 由于植物叶绿体表达系统能够高效表达目的基因、环境安全性高,已成为目前植物生物反应器研究的热点之一。在本文中作者将O型口蹄疫病毒VP1抗原基因分别重组和转化到模式植物烟草和衣藻的叶绿体基因组中,并使其得到高效表达,为利用植物叶绿体表达系统生产口蹄疫基因工程疫苗提供了技术依据。 论文第二部分主要叙述了烟草叶绿体表达载体PTRVP1的构建,并通过基因枪方法转化烟草叶绿体基因组,获得了3株具有壮观霉素抗性的转化再生植株。经过两轮抗生素筛选后,采用FMDV VP1基因的一对引物和烟草叶绿体同源片段的一对引物分别对抗性植株的叶绿体DNA进行的PCR和PCR-Southern blot分析。结果表明目的基因已经按设计要求定点整合进入烟草叶绿体基因组中,但是经过两轮抗生素筛选所得的转化植株均为杂合体,要达到同质化还需要进一步的抗生素筛选。Western blot和ELISA免疫杂交分析证明FMDV VP1抗原蛋白在烟草叶绿体中得到表达,表达量占可溶性总蛋白量的2%~3%(1mg可溶性总蛋白含有20~30μg的VP1蛋白)。 论文第三部分主要叙述了将O型FMDV VP1与强黏膜免疫佐剂霍乱毒素B亚基(CTB)的融合基因克隆重组到衣藻叶绿体表达载体中,并采用基因枪法转化衣藻叶绿体,获得了具有壮观霉素抗性的转化子。其中挑取3个抗性转化子进行三轮的抗生素同质化筛选。并根据衣藻叶绿体同源片段chlL基因,设计一对引物对其叶绿体DNA进行的PCR和Southern blot分析。结果表明外源基因已经定点整合入衣藻叶绿体基因组的chlL基因中,并且经过三轮抗生素筛选所得的衣藻叶 绿体转化子中,转基因型叶绿体基因组拷贝占多数。W七stern blot和ELISA免疫 杂交分析表明CTBVPI融合蛋白在衣藻叶绿体中得到表达,表达量占可溶性总蛋 白量的3一4%(lmg可溶性总蛋白含有30一40 pg的重组蛋白)。GM一EuSA结合分 析证明衣藻叶绿体所表达的CTBVPI融合蛋白能够正确地折叠,显示出一定的生 物学活性。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q785

【引证文献】
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