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《浙江大学》 2003年
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球形纤维素/钛白粉复合扩张床吸附剂的制备及其在蛋白质纯化中的应用

雷引林  
【摘要】: 扩张床吸附(EBA)技术是一种新型的生化分离技术,它集成了固液分离、浓缩和初期纯化于一步单元操作之中,可以直接从含有细胞和细胞碎片的发酵液或培养液中提取目标蛋白,而不必事先除去悬浮的固体颗粒。吸附剂基质是决定EBA技术能否成功应用的关键性因素,它首先必须具有合适的密度和粒径分布。 本文旨在通过“反相悬浮热再生”法制备一种纤维素-钛白粉复合微球,作为扩张床基质。使用环氧氯丙烷活化,然后与二乙胺反应,基质被衍生成一种阴离子吸附剂(Cell-Ti DEAHP);另外,通过环氧氯丙烷交联后与氯乙酸反应,基质还被制成一种阳离子交换剂(cell-Ti CM)。考察了吸附剂在扩张床中的扩张行为、流体力学特性和蛋白质吸附能力。最后,所开发的阴离子吸附剂被应用于从细胞匀浆中提取脱卤酶,而阳离子交换剂则被用来从发酵液中提纯纳豆激酶。 全文共分为四个部分。第一部分集中综述了扩张床吸附剂基质的研究进展,包括基质所需要的理化性质、常见的扩张床基质和它们的制备方法。在分析和比较已有扩张床基质优缺点的基础上,作者提出了自己的研究思路,即采取再生纤维素和超细钛白粉分别作为反应性骨架材料和增重剂,复合制备出球形亲水性扩张床基质。此外,还建立了一系列表征所制备的扩张床基质和吸附剂的方法。 第二部分主要叙述纤维素-钛白粉复合扩张床基质和吸附剂的制备方法。详细研究了一些影响复合微球形成的因素,得到较优的工艺条件为:纤维素黄原酸酯粘胶粘度为5000~8000cSt,分散相为6:1(w/w)泵油和氯苯混合物,搅拌速度为350~400rpm。在此工艺条件下,复合基质具有规则的球形外观和与商业Streamline系列基质相当的粒径分布。研究表明,钛白粉加量的增加会使基质的密度线性增加,但对基质的孔结构影响不大,说明超细颗粒已被有效地包埋进再生纤维素骨架之中。由此制得了一种典型的复合基质(Cell-Ti)的理化性质如下:密度1.21g/mL、比表面积38.7m~2/mL、孔度83.7%和含水率69.5%。 此后,为了得到足够的环氧基团用于功能基化,详细考察了一些影响活化反应的因素,如环氧氯丙烷的用量、NaOH溶液的浓度、纤维素和钛白粉的含量等。当NaOH溶液浓度为2.5~3.0mol/L且环氧氯丙烷相对过量时,活化基质中的环氧基含量达220μmol/mL,由此产生的阴离子吸附剂的离子交换容量为0.20mmol Cl~-/mL。基质经过环氧氯丙烷交联后机械强度得到了很大的提高,用氯乙酸功能基化后的离子交换容量为0.22mmol Na~+/mL。扫描电镜照片显示复合基质具有大孔结构。 第三部分测试了所开发吸附剂的扩张床性能和蛋白质吸附能力。研究表明,Cell-Ti DEAHP的扩张行为遵循Richardson-Zaki关系式,在水流动相中的扩张指数为5.2,终点沉降速度约为1960cm/h。吸附剂起始装填高度的降低和流体相粘 摘要 度的增加会使扩张床中的轴向混合程度加剧。尽管如此,在实验范围内,所开发 的吸附剂在扩张床内的流动仍然可以近似为平推流。 研究发现,cell一TIDEAHP和cell一TicM的吸附等温线都遵从Lan脚uir等温 式。其中,cell一Ti DEAHP的平衡吸附容量Qm为61 mg/mL BsA,解离常数局 为0.11 mg/mL;而cell一Ti cM的Qm为98.7 mg/mLlysozyme,幻为0.349mg/担L。 测试了固定床和扩张床中不同初始浓度和吸附剂装填高度下的蛋白质穿透行为, 表明随着流速和初始浓度的增加,以及装填高度的下降,穿透曲线的斜率变缓; 从穿透行为来看,扩张床中的吸附效率与固定床中的相当。用Hall方程来评价和 预测扩张床中蛋白质的穿透行为,但需要事先测定相同初始浓度下的固定床穿透 曲线。研究证明,在一定的流速范围以内Hall模型计算值能与实验结果相符合。 第四部分是吸附剂的纯化应用实例。将阴离子吸附剂Cell一Ti DEAHP应用于 从细胞匀浆中提取脱卤酶,总收率为68%,纯化倍数达22倍;将阳离子吸附剂 cell一Ti cM应用于从发酵液中提取纳豆激酶,收率达89%,纯化倍数为5,6倍。 较之于传统的提取工艺,扩张床吸附技术节省了大量的操作时间和生产成本,充 分显示出其高效和集成化的特点。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:TQ424;TQ028

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【引证文献】
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