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《浙江大学》 2004年
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氨基酰化酶法拆分制备手性氨基酸

钟琦  
【摘要】: 氨基酸是构成蛋白质的基础,同时也是一种十分重要的营养物质,它在生命活动中起着举足轻重的作用。 在传统的20种天然氨基酸中,除没有手性中心的甘氨酸外,其他19种氨基酸均为L构型。随着研究的不断深入,越来越多非天然构型—D型氨基酸的作用被发现,它们的需求也随之产生。对于L型和D型都有利用价值的氨基酸,化学合成结合手性拆分的方法,具有低成本、适于大规模生产等优点。而高效、绿色、安全的氨基酰化酶法拆分,是拆分氨基酸的最佳方法之一。 蛋氨酸和苯丙氨酸,都是人体必需的氨基酸。蛋氨酸是一种重要的饲料添加剂。L-苯丙氨酸是合成抗病毒和抗癌药物及人工甜味剂的原料,D-苯丙氨酸能增强人体的免疫功能,具有出色的镇痛作用。 首先,选取了氨基酰化酶含量较为丰富且方便易得的米曲霉3042作为酶源。通过硫酸铵分级沉淀、Sephadex G50凝胶层析和DEAE-Sepharose阴离子交换层析从米曲霉3042中提取到了米曲氨基酰化酶,该酶的纯化倍数为54.29,比活为647.66U/mg,总收率为49.53%。以N-乙酰-DL-蛋氨酸为底物的酶促反应最适pH为7.5-8.0,最适反应温度随催化反应时间的延长而降低,缓冲体系中的离子对酶活有抑制作用,而低浓度的CO~(2+)对酶活有激活作用。 将游离酶用于拆分Met和Phe。最佳拆分条件和拆分结果分别为: Met:反应温度为37℃;pH7.5;Co~(2+)浓度为5×10~(-4)mol/L;初始底物浓度为0.3mol/L。产品:L-Met,%O.P=96.2%,收率70.5%;D-Met,%O.P=95.3%,收率50.5%。 Phe:反应温度为37℃;pH7.0;Co~(2+)浓度为5×10~(-4)mol/L;初始底物浓度为0.2mol/L。产品:L-Phe,%O.P=98.6%,收率68.2%;D-Phe,%O.P=97.1%,收率60.1%。 之后,采用了离子交换凝胶吸附法和海藻酸钙微胶囊包埋法对酶进行固定化。 吸附法所选用的固定化介质是国产DEAE-Sepharose凝胶。研究表明,固定化DSA的热稳定性明显优于游离酶。利用DSA柱进行Met的连续拆分,稳定工作30天后,酶活仍保留60%以上。经初步估算,氨基酰化酶固定化后,酶活利用率提高10倍以上,具有良好的工业应用前景。 包埋有氨基酰化酶的海藻酸钙凝胶珠分别与聚阳离子PMCG和PDMDACC形成微胶囊。对于本体系,两种聚阳离子具有相似的效果。两种微胶囊酶的固定化率都较高,同时酶的泄漏问题也得到了较好的解决。但是随着反应次数的增加, 浙江大学硕士学位论文 摘要 微胶囊的操作稳定性随之下降。在应用之前,还需解决微胶囊的易损坏问题。 最后,用明胶和戊二醛固定化液态发酵得到的含有胞内酶的米曲霉菌。比较 了游离菌体和固定化菌体的性质,结果显示固定化后菌体的稳定性明显提高。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:TQ22

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【引证文献】
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【参考文献】
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9 陈美娟;噬菌体展示青霉素G酰化酶大肠杆菌—枯草杆菌通用表达载体的构建[D];扬州大学;2002年
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