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《浙江大学》 2004年
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纳豆激酶液体发酵过程的优化以及层析法纯化细胞色素P450_(BM-3)的研究

黄俊  
【摘要】: 本论文分为两部分,第一部分为纳豆激酶液体发酵过程的优化,第二部分为层析法分离纯化P450_(BM-3)。 纳豆激酶(Nattokinase,NK)是从日本传统食品纳豆发现的一种具有纤溶活性的酶。本论文考察了在种子瓶加入木糖对发酵过程的影响,1g·L~(-1)的木糖能缩短产纳豆激酶(NK)菌株(Bacillus subtilis HL-1)的延滞期,使纳豆激酶的酶活从1314IU·mL~(-1)提高到1698IU·mL~(-1),接着在3.7升Bioengineering KLF2000型发酵罐进行培养,研究发现菌浓和溶氧是影响菌体产酶的重要因素,利用在稳定期维持溶氧在30%~40%之间,在菌浓下降时进行分批补料,最终发酵液中纳豆激酶的酶活由摇瓶时的1314IU·mL~(-1)提高到在3.7升发酵罐中的2348IU·mL~(-1)。 细胞色素P450_(BM-3)是从Bacillus megaterium中分离出来的一种单加氧酶,它能催化长链脂肪酸(C_(12)-C_(20))ω-羟化以及非饱和长链脂肪酸的羟化或环氧化,其基因已经被克隆并在大肠杆菌中有效表达。本论文主要工作是将已构建好的表达P450_(BM-3)的质粒转入大肠杆菌DH5α中,对其发酵条件进行了优化,并通过层析方法有效地分离提纯P450_(BM-3)酶。 已构建好的表达P450_(BM-3)的质粒先转入大肠杆菌DH5α中,然后考察了氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)的浓度以及接种量对菌体生长的影响,结果表明Amp浓度的增加对菌体的生长有一定的抑制作用并且接种量的减少导致延滞期增长。P450_(BM-3)的培养条件被优化,结果表明接种量1%,发酵培养基装液量为100mL/500mL,FeCl_3的添加量为0.1mg/L,在OD_(578)(菌浓)达到0.5~1.3之间升温至42℃,诱导时间为5小时,能提高目标蛋白的表达量,为下游纯化提供较佳的原料。 对硫酸铵分级沉淀以及凝胶过滤分离P450_(BM-3)的条件进行了优化,结果表明35%~70%的饱和硫酸铵浓度适合P450_(BM-3)初分离,Sephacryl S-200凝胶过滤的流速为0.5mL/min,确定了以下分离纯化路径:发酵液离心收集菌体→细胞破碎离心收集上清液→35%~70%饱和硫酸铵分级沉淀→缓冲液溶解沉淀→Sephacryl S-200凝胶层析,纯化倍数2.316,酶活收率49.8% Abstraet nEAE一sepharose FF、ResoureeQ以及ANX三种介质分离纯化p45o~的 结果表明,目标蛋白均能交换到三种介质上去,不同的是对P450BM-:特异性吸附 不同,经sDs一PAGE电泳表明DEAE一sePharose FF纯化效果最差,不适合分离 P450BM-,。确定了以下分离纯化路径:发酵液离心收集菌体一细胞破碎离心收集 上清液一ResourceQ阴离子交换层析一SePhacry1S一200凝胶层析,纯化倍数3.4, 酶活收率达18%。 通过对本实验室己经存在疏水介质的筛选表明,source 1 5150与Phenyl sepharose枷High Perrormanee能较好地吸附目标蛋白P45o、了,对souree 1 5150 吸附目标蛋白p45o、,的条件进行了一些优化,确定1 .oM(N H4)2504,pH7一8 的缓冲液作为上样缓冲液,洗脱时梯度长度为4一SCV,流速为lmL/min的条件, 可以较好地分离目标蛋白p45o、,。Phenyl sepharoseTM High Per伪rmanee当全部 用10mM PBS洗脱缓冲液洗脱时,目标蛋白才能被洗下来。确定了以下分离纯 化路径:发酵液离心收集菌体一细胞破碎离心收集上清液一35%一70%饱和硫酸 按分级沉淀一上样缓冲液溶解沉淀一source 1 5150疏水层析~SephacrylS一200凝 胶层析,纯化倍数13.5,酶活收率13.7%。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:TQ925

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1 邓刚;静电相互作用主导的双水相胶束系统研究[D];浙江大学;2005年
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【参考文献】
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1 谢秋玲,郭勇;纳豆激酶液体发酵条件的优化[J];华南理工大学学报(自然科学版);1999年05期
2 唐振华;昆虫中的细胞色素P-450及其特性[J];昆虫知识;1990年01期
3 许华夏,李培军,刘宛,宋玉芳;生物细胞色素P450的研究进展[J];农业环境保护;2002年02期
4 邱星辉,冷欣夫;细胞色素P450的多样性[J];生命的化学(中国生物化学会通讯);1997年06期
5 胡升,梅乐和,姚善泾;响应面法优化纳豆激酶液体发酵[J];食品与发酵工业;2003年01期
6 王云,郭敏亮,姜守磊,陈天,姜涌明,陈云;一种疏水色谱填料的特性及应用的研究[J];色谱;2000年04期
7 巩宗强,李培军,王新,张海荣,张春桂,李彬;污染土壤中多环芳烃的共代谢降解过程[J];生态学杂志;2000年06期
8 王云,常玲,吴金男;疏水色谱法及其在生物大分子分离纯化中的应用[J];烟台师范学院学报(自然科学版);2002年02期
【共引文献】
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1 林思祖;曹光球;丁国昌;刘宝;;杉木叶片蛋白质提取方法的改良[J];安徽农学通报(上半月刊);2009年17期
2 崔林开;叶华智;;3种ELISA法检测Bt杀虫蛋白的比较研究[J];安徽农业科学;2005年11期
3 房妮;俱国鹏;;多环芳烃污染土壤的微生物修复研究进展[J];安徽农业科学;2006年07期
4 王自良;张海棠;王艳荣;张改平;;氯霉素人工免疫原的合成与鉴定[J];安徽农业科学;2006年09期
5 张丽霞;张国强;;大蒜蛋白酶抑制剂的分离纯化与部分性质研究[J];安徽农业科学;2006年18期
6 姜琼;赵璇;马明;;豆豉纤溶酶产生菌的筛选[J];安徽农业科学;2007年01期
7 陆云华;张新;;豆豉纤溶酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[J];安徽农业科学;2007年23期
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1 王在贵;何瑞国;钱世钧;刘朝良;;特异腐质霉纤维素酶的酶谱分析[A];现代农业理论与实践——安徽现代农业博士科技论坛论文集[C];2007年
2 张新妙;马润宇;;用膜结晶技术制备蛋白质晶体的研究[A];第二届全国膜分离技术在食品工业中应用研讨会论文集[C];2006年
3 高娟;唐明森;王艳玲;蒋再学;竺薇;罗满林;;重组猪α干扰素发酵工艺的研究[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
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5 朱勤勋;严雪;韩友斌;;鼠源IgG抗体F(ab')2片段及Fab片段的制备纯化及其免疫活性研究[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年
6 王宏俊;安烨;龚玉梅;陈小玲;张培君;;Modesto株副鸡禽杆菌血凝素基因的克隆表达及生物活性鉴定[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
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1 苏峻峰,任丽,王立新;微胶囊技术及其最新研究进展[J];材料导报;2003年S1期
2 肖进新,暴艳霞,方磊;正负离子表面活性剂与高聚物混合双水相体系的相行为及蛋白质的分配[J];高等学校化学学报;2001年01期
3 李伟,孙建中,周其云;适用于酶包埋的高分子载体材料研究进展[J];功能高分子学报;2001年03期
4 李明威,宋双雪,武国山;漫话靛蓝今昔──纪念合成靛蓝一百周年[J];染料工业;1995年01期
5 谭平华,林金清,肖春妹,郝三存;双水相萃取技术研究进展及应用[J];化工生产与技术;2003年01期
6 林东强,朱自强,姚善泾,梅乐和;生化分离过程的新探索──双水相分配与相关技术的集成化[J];化工学报;2000年01期
7 高莹,郑用熙;表面活性剂双水相的性质及其应用 Ⅱ.表面活性剂双水相在生物活性物质中的应用[J];化学学报;1996年05期
8 高莹,郑用熙;表面活性剂双水相的性质及其应用 Ⅰ.表面活性剂双水相的微环境性质[J];化学学报;1996年05期
9 肖进新,黄建滨,何煦,暴艳霞,朱(王步)瑶;蛋白质在表面活性剂与高分子共组双水相体系中的分配[J];化学学报;2000年07期
10 陈顺清,杨亚江;聚皂溶液及其紫外-可见探针光谱研究[J];华中理工大学学报;1998年07期
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2 陆瑾;温度诱导双水相金属螯合亲和分配技术的研究[D];浙江大学;2004年
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1 柴燚;中空海藻酸钙微胶囊的性质及其固定化枯草杆菌生产纳豆激酶的研究[D];浙江大学;2004年
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1 刘娟;朱建航;范杰平;;去污剂/聚合物双水相体系在膜蛋白分离中的应用[J];江西科学;2008年03期
2 辛嘉英;王艳;章俭;宋昊;夏春谷;;生物合成靛蓝的研究进展[J];现代化工;2008年07期
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1 王艳;萘降解菌生物降解萘及合成靛蓝研究[D];哈尔滨商业大学;2010年
2 许炳雯;基因工程菌BphAB_(LA-4)转化吲哚行为的研究[D];大连理工大学;2012年
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1 沈东升,徐向阳,冯孝善;微生物共代谢在氯代有机物生物降解中的作用[J];环境科学;1994年04期
2 苏月来,谢雨生,张建中,徐向阳;有毒难降解有机物废水处理的生物强化技术[J];环境污染与防治;1999年01期
3 谢秋玲,郭勇;纳豆激酶液体发酵条件的优化[J];华南理工大学学报(自然科学版);1999年05期
4 张希凤,孟宪清,李群伟,金英姬,李玉兰,朱大岭,马玉彦,张希荣;复方丹参片、阿斯匹林和潘生丁对细胞色素P-450的影响[J];哈尔滨医科大学学报;1995年02期
5 黄俊勇,冷欣夫;溴氰菊酯对家蝇细胞色素P-450含量的影响[J];昆虫学报;1992年03期
6 吴益东,杨亦桦,陈进,李爱玫,沈晋良,沈文飚;增效醚(PBO)对棉铃虫细胞色素P450的抑制作用及对拟除虫菊酯的增效作用[J];昆虫学报;2000年02期
7 吴益东,沈晋良,陈进,周威君,李爱玫,沈文飚;棉铃虫六龄幼虫微粒体细胞色素P450和细胞色素b_5的测定及组织分布[J];农业生物技术学报;1997年03期
8 耿益民,王雯,芦玲巧,杨啸林,张立克;大鼠心肌组织与肝脏组织中细胞色素P-450的含量测定[J];首都医科大学学报;1999年01期
9 李孱,白景华,蔡昭铃,欧阳藩;细菌素发酵培养基的优化及动力学初步分析[J];生物工程学报;2001年02期
10 邱星辉,冷欣夫;细胞色素P450的多样性[J];生命的化学(中国生物化学会通讯);1997年06期
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1 江晓 ,董明盛 ,江汉湖;一种食源性纤溶酶(纳豆激酶)酶学性质的研究[J];中国酿造;2002年01期
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4 陈启和,何国庆;纳豆激酶的研究进展[J];食品与发酵工业;2001年12期
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6 董明盛,江晓,刘诚,江汉湖;纳豆激酶稳定性的研究[J];食品与发酵工业;2001年04期
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8 齐凤兰,奚锐华,陈有容;纳豆中营养与活性成分的分析研究[J];中国食物与营养;2004年02期
9 鲍艳霞,钱之玉,陈钧,倪孟祥,王萍;豆渣固体发酵产纳豆激酶的工艺优化及其部分酶学性质研究[J];大豆科学;2005年01期
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1 何彬彬;柴同杰;;纳豆激酶的功能及研究进展[A];第四届第九次全国学术研讨会暨饲料和动物源食品安全战略论坛论文集(上册)[C];2008年
2 丁有学;刘兰;;纳豆激酶研究进展[A];2007年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2007年
3 王正刚;丁贵干;蔡正森;;纳豆激酶的溶栓作用研究[A];全国中西医结合周围血管疾病学术研讨会论文选编[C];2001年
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1 李木子;纳豆不等于纳豆激酶 说纳豆溶血栓是张冠李戴[N];粮油市场报;2011年
2 记者何德功;纳豆激酶可溶化血栓[N];人民日报;2003年
3 徐铮奎;纳豆激酶陷信任危机 行业亟待规范自律[N];中国医药报;2010年
4 济南大学 张炳文;为了健康吃豆豉吧[N];科技日报;2003年
5 黄世涛;纳豆食品可调理人体生理机能[N];消费日报;2008年
6 刘永坤;台湾生物科技产业闪烁科技之光[N];中国企业报;2010年
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8 张洪军;餐餐吃豆易“受伤”[N];中国医药报;2006年
9 窦光宇;多功能保健食品——纳豆[N];中国医药报;2001年
10 吴宏艳;开启微生物健康新纪元 为食品安全保驾护航[N];中国食品安全报;2011年
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1 刘朔;纳豆激酶基因密码子优化设计与合成及在毕赤酵母中的高效表达[D];南京农业大学;2007年
2 郑忠亮;纳豆激酶结构与功能的研究[D];武汉大学;2005年
3 谢秋玲;纳豆激酶液体发酵的条件优化及其调控的研究[D];华南理工大学;1999年
4 朱立成;纳豆激酶和hGM-CSF在家蚕杆状病毒表达系统中表达纯化及活性研究[D];浙江大学;2005年
5 吕淼华;固体生物质对扩张床吸附的影响和方法研究[D];浙江大学;2005年
6 雷引林;球形纤维素/钛白粉复合扩张床吸附剂的制备及其在蛋白质纯化中的应用[D];浙江大学;2003年
7 陆瑾;温度诱导双水相金属螯合亲和分配技术的研究[D];浙江大学;2004年
8 贾焱;纳豆激酶分子内分子伴侣的研究[D];武汉大学;2013年
9 范晓丹;新型纤溶酶得产生菌选育、发酵优化及酶学性质研究[D];华南理工大学;2006年
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1 陈景鑫;纳豆激酶微胶囊的制备及其稳定性研究[D];黑龙江八一农垦大学;2010年
2 黎婉园;纳豆激酶液体发酵的研究[D];华南理工大学;2011年
3 李妍;产纳豆激酶细菌的筛选及酶学性质的研究[D];山东农业大学;2012年
4 苏雪燕;纳豆激酶分离、纯化及其酶学性质研究[D];曲阜师范大学;2013年
5 徐慧;富硒纳豆激酶的制备及特性研究[D];华南理工大学;2013年
6 朱宇刚;一株高产纳豆激酶的纳豆枯草芽孢杆菌的研究[D];安徽农业大学;2011年
7 霍金柱;高效纳豆激酶菌株的筛选及纳豆生产[D];重庆师范大学;2011年
8 梁爽;纳豆激酶肠溶胶囊的制备及其抗血栓作用的研究[D];吉林大学;2011年
9 王建;纳豆激酶的发酵、纯化条件的优化及开发应用[D];陕西科技大学;2012年
10 古亚楠;纳豆激酶发酵工艺条件优化及其在消化液中的活性研究[D];河南工业大学;2012年
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