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《浙江大学》 2004年
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shRNA表达框的快速制备及其在抗HBV相关研究中的应用

倪勤  
【摘要】: 慢性HBV感染的抗病毒治疗一直是医学界的重大难题,现有干扰素和拉米夫定的临床疗效有限,不断尝试进行的其它治疗方法,至今又尚无令人满意的结果,RNA干扰技术的出现,为处于困境中的研究又带来一线新的希望。 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)以序列特异性的方式引发的转录后同源性RNA降解的现象,也称为转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing,PTGS),是生物体针对外来转座子和病毒感染进化形成的一种古老而保守的防御机制。在哺乳动物系统中,短至21-~23-nt的双链RNA可以作为小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)分子在宿主细胞内快速、高效、特异地引发外源或内源性靶mRNA的降解,进而抑制相应基因的表达,却不引起非特异性干扰素应答。这一重大发现使得RNA干扰技术迅速发展成为当今抗病毒、抗肿瘤和蛋白功能分析的有利工具。然而siRNA的有效性高度依赖其靶RNA的特殊位点,尽管在设计siRNA位点时已有一些可供遵循的原则,但这些候选的siRNA最终仍然需要通过大量耗时费力的实验加以验证和筛选,因此建立高效、经济快速筛选获取有效siRNA的方法对RNAi技术的开展应用具有重要的实际意义。 良好的筛选体系首先取决于快速、经济地获取siRNA的方法。化学合成siRNA成本太高,体外转录生物合成的方法在RNA操作上较困难,而载体表达方法在载体构建时又较繁琐耗时。相比而言,直接采用PCR制备siRNA或shRNA表达框(siRNA expression cassettes, 浙江人学!刃卜学位价气沁 SEC)的方法则以其经济、快捷的优势而成为筛选siRNA及其最适搭配启动子非常有效的__l: 具。通常SEC包含一个RNA聚合酶启动子、一段shRNA编码片断和一个RNA聚合酶终!卜 序列。为避开含有二级结构shONA扩增困难的问题,一般采川两步PCR反应,但是这种方 法可能会因两次PCR反应而增加碱基错掺率,从而影响.高度序列特异的RNAi效应。因此, 在本研究第一部分着重探索建立简单高效的重叠延伸一步PCR方法,以能够保质保星地构建 和扩增sEC,少t以增强刑绿色荧光蛋自(enllaneed green fluoreseence protein,EoFp)作为靶 基因,证实PCR制备的SEC用于瞬时RNAi效应研究及有效siRNA筛选的可行性。 人规模siRNA筛选_「作还取决于简便易行、快速准确的效应报告系统。目前应用最为,’‘ 泛的是荧光蛋白,它通过易T-检测的荧光表达来反映与之融合的目标基因表达情况。以此建 立的致病基因表达报告系统,使包括siRNA在内各种墓因治疗方法的效果评估变得方便而高 效。在本研究第二部分,我们即以增强型绿色荧光蛋rl(enhaneed green fluoreseent protein, EGFP)作为报告分子建立HBx瞬时表达的快速报告系统,Jt运川第一部分介绍的重叠延伸一 步PcR法制备针对细胞外源致病基因l一IBx的ShRNA表达框,初步建立了HBx一siRNA快速筛 选体系,将从该体系筛选到的最佳SEC再用J飞稳定表达Fll3v的2.2.15细胞,做进一步验证 及抗HBV的效果评价。 机体内病毒感染的建立取决于病毒和宿土两方面因素,病毒在其各个生活周期中都需要 诸多细胞蛋自功能的辅助和参与。近年研究发现La蛋自是HBV RNA的一个重要稳定因子, 即结构功能完披的小鼠La蛋白能够与HBv RNA的转录后调控序列(HBv pesttranscriPtional regulato叮ele,nent,HpRE)结合,保护存在T. 1 IBv RNAJ二(tJ核酸内tjJ醉切冉IJ位点.使之免遭 核内核酸酶的降解,从而在细胞核内发挥稳定}IBV RNA的玉妥作用。最近有研究报道体外表 达人La蛋自(human La protein,hLa)也可以与日PRE高亲不11力、特异性结合,提示人La蛋 自也可以与也HBV RNA相互作用,但是否直接参与11日v RNA代谢尚不消楚.本研究第二部 分即乍{对细胞内源性基因La蛋自,继续采川SEC介导RNAi的方法,以稳定产生HBV的2.2.15 细胞为实验模型,研究人La蛋自功能与HBV基因表达变化的关系,进而探讨人La蛋自在 HBV RNA代谢表达过程中可能的作用,以及将人La蛋自视为宿上共因子川T-抗日BV治疗靶 标的可行性。 浙江人学协卜学位论文 第一部分:shRNA表达框快速制备方法的建立 方法和结果: 1.重叠延伸一步PcR制备u6+l、Hl、tRNAval三种启动子一sllRNA表达框首先通过PcR 方法制备含有两端相同添加接头的二种RNA多聚酶川(RNA polymerase 111,RNA po,川) 启动子(u6+I、Hl和tRNAVal) PcR引物通川型模板,再设计合成末端延长的3’端长片 段基因特异性延伸引物(包含shRNA编码序列和RNA pol川转录终lr.序列)、及上游和 下游通用引物。用上述模板和引物经重叠延伸一步1’、.、又应即可一次性快速、简捷地获 得结构完整、产物条带单一的三种RNA pol 111一sEC。 2.验证SEC介导的RNAi效应及SEC策略筛选有效siRNA的可行性将针对EGFP两处 siRNA位点的SEC与表达质粒pEGFP一NI共转染日叩GZ细胞,通过荧光显微镜、流式细 胞仪和半定量R不PCR检测分析SEC对EGFP蛋自和mRNA表达的抑制效果。结果证实 T文献报道的siEoFp244有效性,t朋^val不一
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R346

【共引文献】
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