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《浙江大学》 2004年
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人骨髓间充质干细胞对外周血T淋巴细胞体外活化影响的研究

余建  
【摘要】: 骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)是一种存在于骨髓中的非造血组织干细胞,具有自我更新、高度增殖及多向分化的能力,近来研究发现,BM-MSCs除具有支持体外造血,促进体内造血功能重建外,在骨髓移植中还具有抑制移植物抗宿主病(GVHD)的作用。 造血干细胞移植尤其是异基因造血干细胞移植(Allo-BMT)是当前治疗白血病、再生障碍性贫血和多种血液系统疾病的有效治疗方法,但Allo-BMT后的移植排斥和GVHD是影响Allo-BMT临床疗效的主要障碍。目前虽然已有多种治疗方法,但疗效仍有待于进一步提高。由于BM-MSCs具有容易取得、能自我更新和高度增殖的特点,若研究证实其确能起到抑制GVHD的作用,则其将成为一种具有重要临床应用价值的抗移植排斥和GVHD的工具。 有关BM-MSCs抑制GVHD的机理,目前认为主要和其能抑制T淋巴细胞对刺激的反应性有关。多项研究发现,T淋巴细胞无论是被异源性经照射的DC细胞或外周血淋巴细胞,还是被多克隆激活剂激活后,在自体或异体的人BM-MSCs实验组中,T淋巴细胞的增殖均被明显抑制,且这种抑制作用与加入的BM-MSCs的数量成正比。BM-MSCs对CD4~+和CD8~+的淋巴细胞增殖均有抑制作用,这种抑制作用和T淋巴细胞凋亡无关,而与其分泌的细胞因子TGF-β1和HGF相关。但也有学者认为BM-MSCs的抑制作用和IL-10、TGF-β1和前列腺素 浙江大学硕士学位论文 EZ均没有显著相关性。此外还有研究者认为BM一MSCs的免疫抑制作用和可溶性 细胞因子的分泌无关,而和细胞接触有关。因此BM一MSCs抑制T淋巴细胞对刺 激物的增殖反应机理还有待于进一步的研究。 本实验以植物血凝素(P HA)刺激人外周血T淋巴细胞作为反应体系,观察 人BM一MSCs对人外周血T淋巴细胞体外活化的影响,进一步明确人骨髓间充质 干细胞是否具有抑制淋巴细胞对刺激的反应性的作用,并通过T淋巴细胞凋亡检 测及细胞培养上清液细胞因子检测的方法,初步探讨其作用的可能机理。 本研究首先通过Ficon密度梯度离心法,得到低密度的单个核细胞,然后 利用MSCs的粘附特性,分离和纯化MSCs。骨髓单个核细胞接种于培养瓶后, 2一3h细胞开始贴壁,24h后贴壁细胞数目不再增加。48h更换培养液后,贴壁 细胞开始分裂增殖,部分区域形成细胞团簇,细胞呈现梭形外观。2周后,细胞 融合成单层,梭形突起变长,排列有明显方向性,呈漩涡状、网状、辐射状。 培养至2一3周贴壁细胞接近80%一90%融合。传代培养后,传代细胞在12h内完 全贴壁,细胞重新变为梭形细胞,与成纤维细胞形态相似。细胞传代后生长迅 速,增殖快,大约7一10天达到完全融合。 流式细胞术检测显示,体外培养的MSCs表达CD29、CD44和CD166,不 表达CD 14、CD34、CD45和HLA一DRa 淋巴细胞增殖率检测显示,在PHA体外活化T淋巴细胞反应体系中加入无 关供者的BM一MSCs,加入细胞浓度不同,淋巴细胞增殖率不同(F=65.641, P0 .01)。BM一MSCs能抑制淋巴细胞对PHA刺激的反应性,不同MSCs细胞浓 度组之间的差异均具有显著性意义(P0.01)。双因素相关性分析显示BM一MSCs 对淋巴细胞增殖的抑制能力与MSCs和单个核细胞比例呈正相关(r=0.998, P0 .05)。BM一MSCs的抑制作用以MSCs高细胞浓度组(间充质干细胞数量相 当于单个核细胞数量的40%)最为明显,抑制率达到83.95士9.25%,而MSCs 中细胞浓度组(间充质干细胞数量相当于单个核细胞数量的20%)和MSCs低 细胞浓度组(间充质干细胞数量相当于单个核细胞数量的10%)的抑制率分别 为59.82士13.20%和41.08士15.23%。在增殖反应第0天和第3天加入BM一MSCs, 浙江大学硕士学位论文 均能抑制T淋巴细胞增殖,但第0天加入者其抑制作用更为明显,两者相比有 显著性差异(P0.01)。 T淋巴细胞凋亡检测结果显示与对照组相比,BM一MSCs实验组培养5天后 的外周血单个核细胞AnnexinV勺CD3+百分率并没有增加,两者相比没有显著 性差异(P=0.3 10)。 ELISA检测显示阳性对照组和不同MSCs细胞浓度实验组培养上清液中 TGF一pl浓度无显著性差异(F=0.295,P二0.828)。双因素相关性分析显示 BM一MSCs的免疫抑制作用和培养上清液中TGF一pl的浓度无关(r=0.1%,P 二0.875)。而阳性对照组和不同MSCs细胞浓度的实验组培养上清液中IL一10浓 度有显著性差异(F二18.973,P0.01)。与阳性对照组相比,各实验组培养上清 液中的IL一10浓度上升,且不同MSCs细胞浓度实验组之间的差别均有显著意义 (P0 .05)。双因素相关性分析显示BM一MSCs的免疫抑制作用和培养上清液中 IL一10的浓度呈正相关(r=0.999,P0.05)。 综上所述,本实验结果表明①人BM一MSCs能抑制T淋巴细胞对PHA刺激的 反应性,不受MHC分子限制,其抑制能力与MSCs和单个核细胞比例呈正相关。 ②人BM一MSCs的免疫抑制作用和外周血T淋巴细胞凋亡无关。③人BM-MSCs的 免疫抑制作用和细胞培养上清液中TGF一pl浓度无关。④人BM一MSCs的免疫抑 制作用和细胞培养上清液中几一10的浓度呈正相关。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R329.2

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