灯盏花素的心肌保护作用及其机制研究
【摘要】：
缺血性心脏病是一种严重的心血管系统疾病，其发病机制复杂，与机体的很多系统有着密不可分的联系，从细胞和分子层面来看，心肌细胞的物质代谢系统、能量代谢系统和基因表达的各个环节都会或多或少的受到缺血缺氧的影响而发生改变，这种改变同时又参与了心肌缺血性疾病的发病过程。药物一直是防治缺血性心脏病最重要的手段之一。天然产物中许多活性物质具有抗心肌缺血、缺氧作用，因而从天然产物中寻找具有抗心肌缺血、缺氧生理活性的有效物质，是发现、开发新药的重要途径。
灯盏花素系中药灯盏花中提取的黄酮类成分，具有抗脑缺血损伤、改善器官血流动力学和微循环、改善学习记忆等多方面的作用，在临床上已比较广泛的应用，但国内外对灯盏花素心肌保护作用的实验研究的报道比较少，特别是在细胞水平灯盏花素对心肌细胞的保护作用研究。本研究的目的就是结合整体动物冠脉结扎所致心肌梗塞模型和体外的心肌细胞损伤的细胞模型等不同层次的心肌缺血缺氧损伤模型，在整体、组织、细胞以及分子等不同水平上对灯盏花素的心肌保护作用进行研究并探索其保护作用机制。
1、采用犬冠脉结扎后所导致的心肌梗塞模型，通过测定不同时间点心电图ST段总和(∑ST)心外膜电图心肌缺血范围(NST)，以及对心肌梗塞范围的定量组织学检测，研究了灯盏花素对心肌缺血程度和缺血范围的影响。测定了犬冠脉结扎前后血清LDH和CK的变化并观察了灯盏花素对其的影响。在离体心肌组织上测定了灯盏花素对心肌耗氧量的影响。研究结果显示，灯盏花素可显著降低犬冠脉结扎后心外膜电图心肌缺血的程度(∑ST)和范围(NST)，用N-BT染色法得到的结果也证明灯盏花素可减小冠脉结扎所致心肌梗塞的范围；而且灯盏花素可以降低犬冠脉结扎后血清LDH和CK活性的升高，减少心肌耗氧量。证明灯盏花素有良好的抗心肌缺血的作用。
2、用体外培养的乳鼠心肌细胞建立了体外缺氧和氧化(H_2O_2)损伤模型，在心肌细胞体外缺氧模型上，检测了心肌细胞体外缺氧后LDH渗漏，在心肌细胞体外氧化损伤模型上，检测了心肌细胞的代谢活性和超氧化物歧化酶(SOD)的活性变化，并观察了灯盏花素对这些指标的影响，研究了灯盏花素对心肌细胞的直接保护作用。研究发现灯盏花素可降低缺氧所致心肌细胞LDH的渗漏，
浙红才学麟士学世触戈
有很好的抗缺氧损伤的作用，并可提高活性氧损伤后心肌细胞代谢活性和SOD
活性，显示出良好的抗活性氧自由基损伤的作用，证明灯盏花素对心肌细胞有
直接的保护作用。
3、在心肌细胞体外缺氧和氧化(HZOZ)损伤模型上，用流式细胞技术结合
内叻exinV-FITC护I染色技术检测了心肌细胞的凋亡和坏死，并研究了灯盏花素
对其的作用，国内外未见报道。很多研究证明心肌细胞凋亡是心肌缺血性疾病
的重要机制之一，心肌细胞凋亡是急性心肌梗塞引起细胞损害的主要方式，而
坏死是继细胞凋亡之后梗塞区细胞进一步丧失的主要原因。实验结果表明灯盏
花素可以显著降低体外缺氧损伤和氧化损伤所致心肌细胞凋亡和坏死比率，有
良好的抗心肌细胞凋亡作用，说明抑制心肌细胞的凋亡是灯盏花素的心肌保护
作用的重要机制之一。
4、在心肌细胞体外缺氧模型上，用共聚焦激光显微技术结合Flu。一3染色
技术研究了灯盏花素对由缺氧所致心肌细胞内Ca，十水平的异常增高的影响，未
见类似报道。研究发现灯盏花素可以抑制缺氧所致心肌细胞内Ca，十的增高，表
明这也是灯盏花素心肌保护作用的重要机制之一，并且与抑制心肌细胞凋亡的
作角密切相关。
5、在心肌细胞体外氧化(HZOZ)损伤模型上，用流式细胞技术结合特异性
抗体荧光染色技术研究了灯盏花素对HZOZ损伤后凋亡相关基因Fas.和Bcl一2表达
的影响，未见类似报道。研究发现损伤所致Fas表达升高的程度远远超过了Bcl一2
表达升高的程度，灯盏花素可抑制损伤所致Fas表达的升高并增强Bd一2的表
达，但其抑制Fas表达的作用要强于增强Bcl一2表达的作用。说明抑制Fas表
达和增强Bcl一2表达是灯盏花素抑制心肌细胞凋亡的重要机制之一。
在以上研究结果的基础上，本研究得出灯盏花素心肌保护作用的作用机制
可能与以下几个方面有关:(1)抑制心肌细胞内Ca2+水平的异常增高，从而减
轻心肌缺血性疾病的发生过程中Ca，+超负荷所造成的对心肌细胞的各种损害。
(2)增强细胞的抗氧化功能，减轻活性氧自由基对心肌细胞的损伤。(3)通
过抑制FaS的表达和轻度增强Bcl一2的表达，同时又在抑制细胞内CaZ+水平的
异常增高和抗活性氧损伤等作用的参与下，抑制心肌缺血性疾病的发生过程中
心肌细胞的凋亡和继发性的坏死，从而起到心肌保护作用。
【关键词】：【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R285
【DOI】：CNKI:CDMD:1.2004.075917
【目录】：
- 中文摘要5-7
- 英文摘要7-10
- 第一章 绪论10-45
- 1.1 心肌缺血性疾病的病理生理基础10-17
- 1.1.1 心脏供血的生理特点与心肌缺血的关系10-12
- 1.1.2 心肌缺血损伤机制12-17
- 1.2 抗心肌缺血天然药物的研究现状17-22
- 1.3 心肌缺血研究及抗心肌缺血药物药效评价的相关方法22-28
- 1.3.1 心肌缺血的相关模型22-24
- 1.3.2 细胞凋亡检测的相关方法24-26
- 1.3.3 细胞内钙离子检测的相关方法26-28
- 1.4 本课题的研究背景、方法以及意义28-45
- 1.4.1 心肌细胞凋亡与心脏疾病28-31
- 1.4.2 钙超载与心肌缺血31-35
- 1.4.3 活性氧自由基与心肌缺血35-40
- 1.4.4 灯盏花素的药理学研究背景40-43
- 1.4.5 本课题的研究目的、方法及意义43-45
- 第二章 灯盏花素对犬冠脉结扎所致心肌梗塞的作用研究45-60
- 2.1 前言45-47
- 2.2 材料与方法47-50
- 2.2.1 实验试剂、材料与器材47
- 2.2.2 在体犬冠脉结扎所致急性心肌梗塞模型的建立及给药剂量分组47-48
- 2.2.3 犬冠脉结扎后心肌缺血程度和缺血范围的测定48
- 2.2.4 犬冠脉结扎前后血清乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)变化的测定48-49
- 2.2.5 犬离体心肌耗氧量的测定49-50
- 2.3 实验结果50-58
- 2.3.1 灯盏花素对犬冠脉结扎后心肌缺血程度和缺血范围的影响50-55
- 2.3.2 灯盏花素对犬冠脉结扎前后血清乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)变化的影响55-57
- 2.3.3 灯盏花素对犬离体心肌耗氧量的影响57-58
- 2.4 分析与讨论58-60
- 第三章 灯盏花素对心肌细胞体外缺氧损伤和氧化损伤的保护作用研究60-72
- 3.1 前言60-61
- 3.2 材料方法61-66
- 3.2.1 实验试剂、材料与器材61
- 3.2.2 新生大鼠心肌细胞的体外培养及鉴定61-63
- 3.2.3 心肌细胞体外缺氧模型的建立及缺氧所致细胞LDH渗漏的检测63-64
- 3.2.4 心肌细胞体外氧化损伤(H_2O_2)模型的建立及损伤后细胞代谢活性(WST)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的检测64-66
- 3.3 实验结果66-70
- 3.3.1 新生大鼠心肌细胞的体外培养及鉴定结果66
- 3.3.2 灯盏花素对心肌细胞体外缺氧所致LDH渗漏的影响66-67
- 3.3.3 灯盏花素对心肌细胞体外氧化损伤(H_2O_2)后细胞代谢活性(WST)的影响67-68
- 3.3.4 灯盏花素对心肌细胞体外氧化损伤(H_2O_2)后超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响68-70
- 3.4 分析与讨论70-72
- 第四章 灯盏花素对心肌细胞保护作用的机制研究72-95
- 4.1 前言72-74
- 4.2 材料与方法74-79
- 4.2.1 实验试剂、材料与器材74
- 4.2.2 心肌细胞体外缺氧损伤后细胞凋亡和坏死的检测74-75
- 4.2.3 心肌细胞体外氧化损伤(H_2O_2)后细胞凋亡和坏死的检测75-76
- 4.2.4 心肌细胞体外缺氧过程中胞内钙离子水平的检测76-77
- 4.2.5 心肌细胞体外氧化损伤(H_2O_2)后凋亡相关基因Fas和Bcl-2表达的检测77-79
- 4.3 实验结果79-87
- 4.3.1 灯盏花素对心肌细胞体外缺氧损伤所致细胞凋亡和坏死的影响79-82
- 4.3.2 灯盏花素对心肌细胞体外氧化损伤(H_2O_2)后细胞凋亡和坏死的影响82-83
- 4.3.3 灯盏花素对心肌细胞体外缺氧所致胞内钙离子升高的影响83-84
- 4.3.4 灯盏花素对心肌细胞体外氧化损伤(H_2O_2)后凋亡相关基因Fas和Bcl-2表达的影响84-87
- 4.4 分析与讨论87-95
- 4.4.1 概述87-88
- 4.4.2 细胞内Ca~(2+)与心肌细胞凋亡88-90
- 4.4.3 氧自由基的损伤与心肌细胞凋亡90-91
- 4.4.4 凋亡相关基因Fas、Bcl-2与心肌细胞凋亡91-94
- 4.4.5 小结94-95
- 第五章 总结与展望95-97
- 5.1 研究工作总结95-96
- 5.2 进一步工作的展望96-97
- 参考文献97-112
- 博士期间相关论文的发表情况112-113
- 致谢113
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