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《浙江大学》 2004年
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两个与抗病、抗逆和发育相关的拟南芥激发标签突变体asr1和dai1的研究

李志邈  
【摘要】: 植物的生长发育与其所处的环境息息相关,在各种环境因素中,逆境对植物的影响尤为重要。逆境通常包括生物逆境和非生物逆境,前者是指病原微生物、昆虫以及杂草等对植物的危害。后者是指高盐、干旱、涝害、低温和高温等对植物的影响,两者相加是造成世界上主要经济作物产量损失的主要因素。因此,在分子水平上研究植物对生物胁迫和非生物胁迫的适应机制不仅有着重要的理论意义,而且还具有重大的经济价值。激发标签技术是建立在功能获得突变基础之上的一项突变体库构建技术,它在分离和研究基因家族的基因、性状不易检测的基因以及性状由QTL(Quantitative trait loci)控制的基因等方面具有独特的优势。此外,激发标签技术得到的突变体通常为显性遗传,其表型可在转基因的T_1代表现出来,为目的突变体的筛选带来了很大的便利。因此,利用激发标签技术构建模式植物拟南芥的突变体库,从中筛选与逆境胁迫相关的突变体,克隆并研究相关基因的功能具有很大的成功可能性和良好的应用前景。 本文以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为实验材料,以激发标签为技术平台,构建了拟南芥的功能获得突变体库,从中筛选具有抗病、抗逆表型的突变体,克隆基因并进行基因的功能研究,取得的主要结果如下: (1)利用含激发标签质粒pSK1015的农杆菌直接转化拟南芥植株,以抗除草剂的Bar基因为筛选标记,获得了约有12000个独立转化株系的突变体库,并从中筛选到2个与抗病、抗逆和发育相关的突变体asr1(auxin and salicylic acid responsive 1)和dai1(drought tolerant and abscisic acid insensitive 1)。 (2)通过质粒拯救克隆到了ASR1基因,并在野生型拟南芥Col-0中进行了转基因验证。ASR1属于生长素相关的GH3基因家族,它编码的蛋白质在突变体内过量表达,并造成植株矮化,莲座叶片向下卷曲,侧根发生受到抑制等形态表型的改变,同时,ASR1可能还参与了植物体对抗病信号分子水杨酸的调控或修饰过程,并使asr1突变体对病原菌丁香假单胞杆菌的侵染更敏感。 (3)构建了ASR1的原核表达载体并在大肠杆菌中进行了高效表达,得到了相应的多克隆抗体。Western杂交的结果表明,与野生型相比,ASR1基因不仅在转录水平上超表达,而且在翻译 摘要 的水平上也超表达,并且纯合子的表达丰度高T.杂合子。此外,还构建了ASRI与GFP(绿色荧 光蛋白)融合蛋白的表达载体pCAM一AsRI一GFP,洋葱表皮瞬时表达系统显示AsRI:G FP融合蛋 自土要定位T.细胞壁中。 (4)对dail突变体进行了初步的抗逆表型分析,发现dail对高盐、干旱等渗透胁迫的适应 性比野生型Shahdara显著提高,并且对植物逆境激素脱落酸的反应不敏感,通过TAIL一PCR将刀以11 定位于拟南芥的2号染色体上。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S432

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