油菜高效再生体系的创建及农杆菌介导法基因转化研究

【摘要】： 油菜是世界上主要的油料作物，长久以来，育种家对此类作物进行了广泛的品种改良，但常规育种方法常局限于种质资源的匮乏。植物基因工程技术在农业上的应用为有效改良油料作物提供了新的途径。但从整体上看，油菜遗传转化的效率均不太高，基因转移成功的材料仅局限在个别品种上。本论文主要以甘蓝型油菜无菌苗子叶和下胚轴为材料，较系统地研究了甘蓝型油菜子叶和下胚轴外植体高效再生的影响因素、农杆菌介导法甘蓝型油菜转化体系的研究，试验结果如下。 1．甘蓝型油菜不同子叶外植体的再生以完整子叶-子叶柄外植体再生能力比半子叶-子叶柄外植体再生能力强；子叶外植体高效再生体系为：以MS为基本培养基，4～5d苗龄子叶外植体先在含2，4-D1mg／L的MS培养基上预培养3d诱导产生愈伤组织，再转接到含有BA3 mg／L、NAA0.15mg／L和10mg／LAgS_2O_3的分化培养基(添加蔗糖30g／L，琼脂7.5g／L，pH5.8)上诱导芽的分化，子叶外植体的芽再生频率达96.7％。在此再生体系培养基上，子叶外植体接种后第二天就开始膨大，并在切口处产生愈伤组织，到预培养3d、分化培养7d后，切口处尤其是子叶柄连接处为坚实、致密的愈伤组织所包围，可见芽的再生，部分外植体产生不定根。分化培养25d外植体培养结束。 2．不同基因型子叶外植体再生能力不同，以甘蓝型油菜(Brassica napus)N1品种子叶外植体芽再生频率最高(83.6％)，其次为埃塞俄比亚芥(B．carinata)品种C1(76.7％)，白菜型油菜(B．rapa)R5品种表现为较低的再生能力(10％)，但有较高的再生外植体数目(5.64～1.33)。不同芸薹属油菜间子叶外植体的再生以芥菜型油菜(B．juncea)最高，甘蓝(B．oleracea)和白菜型油菜(B．rapa)因含AA染色体，再生较难；甘蓝型油菜(B．napus)和埃塞俄比亚芥(B．carinata)介于两者之间。 3．在芸薹属油料作物中子叶外植体较易再生，但不易转化，而下胚轴外植体利于农杆菌介导的转化。在本试验中下胚轴外植体高效再生体系为：以MS为基本培养基，4～5d苗龄的上端下胚轴外植体先在含2，4-D1.5mg／L的MS培养基上预培养7d诱导产生愈伤组织，再转接到含有BA4 mg／L、NAA0.1mg／L和10mg／L AgS_2O_3的分化培养基(添加蔗糖30g／L，琼脂7.5g／L，pH5.8)上诱导芽的分化，下胚轴外植体的芽再生频率为96.7％。 4．不同基因型在不同培养上下胚轴外植体芽的再生频率变化较大，可以从甘蓝型油菜N3 品种最高70.0%(BA3mg/L、NAAo.xmg几培养基)至N4、N6品种在BA4mg/L、NAAo.zm叭 培养基上没有芽的再生。基因型和培养基与下胚轴外植体芽的再生呈显著性差异，不同培养基、 不同基因型是决定下胚轴外植体芽再生的主要因素。 5.甘蓝型油菜不同类型外植体再生能力不同。花序梗、子叶、一下胚轴和真叶柄四种外植体， 以子叶外植体芽再生频率最高(56.7%)，花序梗再生能力最低(仅为10乃%)，其次为下胚轴 (33.3%)和真叶柄(23.3%);真叶柄具有最高的再生外植体数目(3.23)，其次为花序梗(3 .00) 和子叶(l .57)。利用无菌苗子叶作为外植体具有诸多优点，外植体来源多且不受季节限制，另 外也可减少外植体的污染程度。 6.通过对根癌农杆菌转化多种因素的比较和探索，建立了农杆菌介导的转化体系。以甘 蓝型油菜Nl品种无菌苗完整子叶一子叶柄外植体，预培养2d，经农杆菌EHA 105(含有质粒 pDW151)感染10一15min共培养48h，在含卡那霉素(Kan)一smg/L抗性不!I梭节青霉素(ear) 50om叭培养基上筛选得到转化体，在现有品种上转化频率为2.5%。转化体经PcR检测外源 基因己整合到甘蓝型油菜基因组中，转化植株的大田试验有待于进一步研究。此外，用下胚轴 外植体作为转化受体时未筛选到转化体。这与现有的研究报道不尽一致，也有待于进一步研究。