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BcpLH反义基因在大白菜中的转化及其功能的研究

严继勇  
【摘要】: 大白菜(Brassica campestris L. ssp. pekinensis (Lour.)Olsson, syn. B. rapa L. ssp. pekinensis)是原产于我国的重要蔬菜之一。在长期自然进化和人工选择的共同作用下,形成了以储藏营养为功能器官的叶球,这种叶球的形态多种多样。一般认为,叶球的紧实度是重要的农艺性状之一,而叶球是由叶数不等的球叶弯曲抱裹或抱叠形成的。因此,要了解叶球的形成规律,就需要从球叶的弯曲机制着手。现有的植物生理学研究认为,植物激素特别是IAA在叶片的弯曲上起重要作用,将IAA合成中的色胺酸加氧酶基因aux1利吲哚乙醛还原酶基因aux2转入大白菜中的实验也支持了生理学的这一推测。何玉科实验室利用差异筛选法从大白菜包心期茎尖组织cDNA文库中分离得到了一个特异表达的新基因BcpLH。根据BcpLH基因的碱基序列及推测的蛋白质氨基酸序列进行同源性比较的结果,认为该基因具有双链RNA结合蛋白的结构特征。PCR表达分析显示,该基因更倾向于在大白菜结球前期的球叶中优势表达,当向大白菜喷施外源激素IAA时,体内BcpLH的转录本含量升高了,进而推测该基因的功能与大白菜球叶的发生发育有关,并可能受IAA的诱导。拟南芥HYL1基因也具有双链RNA结合蛋白基因的特征,其突变体的表型是叶片卷曲,并对外源激素有异常反应。在以上基础上,为了初步获得一些该基因在大白菜中的功能信息,我们通过真空渗透法和花蕾注射法将反义BcpLH基因转入大白菜和白菜(B. campestris L. ssp. chinensis (L.) Makino var. communis Tsen et Lee)中,观察转化株的形态变化;对转化株施加外源激素IAA,6-BA和ABA,了解其对这三种激素的反应,同时对上述两种原位转化方法中影响转化效率的因子进行了初步的研究,获得如下主要结果: (1)转化株从苗期到生殖期,均有一系列的形态变化,主要表现在:叶片数增加、叶片颜色加深、叶面较皱、叶片上的刚毛较多、叶片有向外卷曲的趋势、叶间距变小、抽薹期推迟(10 d左右);除大部分花器官发育正常外,也发现个别植株的雄蕊出现退化、育性下降的现象,其中一转化株出现了花图式的突变,在子房内侧着生多级完全花,呈现嵌套式花发育模式。 (2)不同种类和浓度的外源激素对转化株苗期主要器官的生长有不同的作用。IAA处理后转化株叶色变淡,叶片外卷。转化株叶片、叶柄、下胚轴和主根的生长对IAA的敏感性比对照低。 (3)6-BA的浓度在0.1mM以下时促进叶片的生长,低浓度的6-BA对转化株叶片细胞体积的扩大效应小于对照株,高浓度时则相反。转化株叶和叶柄生长对6-BA的刺激反应敏感,而下胚轴和根的生长对6-BA的刺激反应迟钝,即使6-BA是在高浓度下,也一直对下胚轴的生长起促进作用。以0.1mM为拐点,低浓度6-BA促进主根生长,高浓度则抑制生长。 (4)ABA对叶形指数及叶柄生长的影响在转化株和非转化株间表现出低浓度抑制效应小高 摘要 浓度抑制效应强的相同趋势,但ABA对转化株叶片和叶柄生长的抑制作用强于对非转化株的抑 制作用,表现为敏感性升高了,而对转化株下胚轴及主根的抑制效应一直比较弱,似乎说明转化 株的下胚轴与主根的生长对ABA反应迟钝,敏感性下降了。鉴于转化体在整个生育期都有表型 变化,并且对激素有异常的反应,我们认为,B印LH可能是上游调控基因,其功能与其说与结球 相关不如说可能与激素产生或转运有关。 (5)影响真空转化效率的主要因子是花蕾发育阶段、蔗糖浓度和表面活性剂SilwetL一77的 浓度。长度在1一3 mm时的中花蕾有利于转化;其次是长度小于1 mm的小花蕾,长度大于3 mm 的大花蕾未能获得转化株。在蔗糖浓度为5%及silwetL一77浓度为0.02%的配比下,中花蕾获得 最高转化率0.%%。蔗糖或SilwetL一77浓度过低都使转化效率大幅度下降,而蔗糖浓度高于10% 或SilwetL一77浓度高于0.1%植株则不能存活。 (6)花蕾注射法影响转化效率的主要因子也是花蕾发育阶段、蔗糖浓度和表面活性剂Silwet L一77的浓度。花蕾长度在1一3 mm时有利于转化,其次是大花蕾,小花蕾在转化中易受伤,难 以存活。在蔗糖浓度为5%及SilwetL一77浓度为0.02%的配比下,中花蕾获得0.56%的转化率。 蔗糖或silwetL一77浓度过低也都会使转化效率大幅度下降,而蔗糖浓度高于10.0%或SilwetL一77 浓度高于0.1%时,花蕾易黄化脱落。 (7)转化的反义BcPLH基因大多以单拷贝方式插入,且能稳定遗传。


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