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《浙江大学》 2004年
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农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立及CBF耐逆相关基因的导入

吴关庭  
【摘要】: 高羊茅是目前正在国内外广泛应用的主要冷季型草坪草之一,利用基因工程技术改良其耐逆性对保持草坪四季常绿,节约水资源,扩大建植区域,尤其是对改善我国西部地区的生态环境具有十分重要的意义。本论文在对高羊茅胚性愈伤组织植株再生与农杆菌介导遗传转化的多种影响因素进行系统研究的基础上,将组成型表达启动子CaMV 35S引导的耐逆相关CBF1基因导入该草种的基因组,获得耐逆性增强的转基因植株。主要研究结果如下: (1)通过对成熟种子愈伤组织诱导、胚性愈伤组织继代发生和分化的多种影响因素的研究,建立了高羊茅胚性愈伤组织植株再生体系。研究表明,高羊茅成熟种子愈伤组织诱导需要较高浓度的2,4-D,以8mg/L 2,4-D与2mg/L ABA配合能获得最佳的诱导效果;种子灭菌后纵切或切胚,可使出愈率成倍提高;采用MS基本培养基和在培养基中添加0.5g/L的水解酪蛋白与谷氨酰胺也有助于提高出愈率;低剂量(10Gy)γ射线辐照处理对成熟种子愈伤组织尤其是胚性愈伤组织形成有一定的刺激效应。在继代培养基中添加0.1~0.2mg/L BAP或2.5mg/L硫酸铜,或将继代培养基中蔗糖浓度提高到60g/L能促进胚性愈伤组织发生,提高胚性愈伤组织频率。高羊茅胚性愈伤组织分化时,BAP的作用要比KT大,但2mg/L BAP与0.5mg/L KT配合可获得更佳的效果;在该细胞分裂素水平下,生长素NAA用0.5mg/L,愈伤组织再生率最高;胚性愈伤组织先在含60g/L蔗糖的分化培养基上高渗预分化,以及经高渗预分化后的致密愈伤组织在琼脂浓度为10g/L的分化培养基上分化,能明显促进愈伤组织的植株再生;在分化培养基中添加脯氨酸导致愈伤组织再生率下降,但同时有减少白化苗再生的趋势。试验还发现,高羊茅成熟种子愈伤组织诱导特别是胚性愈伤组织发生及植株再生存在明显的品种间差异,说明对品种进行选择是必要的。 (2)以gus基因瞬时表达频率为指标,研究确定农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化的适宜条件为:预培养培养基中添加较高浓度(0.5mg/L)的BAP和NAA,预培养时间3~5d;农杆菌悬浮液OD_(600)值0.5~0.7,感染时间10~20min;共培养基pH值5.2~5.6,共培养温度23~25℃,共培养时间3d;农杆菌预培养基和悬浮培养基以及共培养基中均添加100μmol/L的乙酰丁香酮。试验表明,在 农杆菌介导高羊茅遗传转化中,抑菌剂宜选用梭节青霉素;以潮霉素作为选择剂 时,采用低浓度(50一15om留L)连续筛选的方式比较合适,在该方式下,获得 的转基因植株较多。通过以上研究,建立起了农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织遗 传转化体系。 (3)采用所建立的农杆菌介导转化体系在世界上首次将耐逆相关CBFI基 因导入4个供试高羊茅品种的基因组,经PCR检测、GUS组织化学染色、离体 叶片潮霉素抗性鉴定和Sotlthem杂交分析,共获得112株独立来源的转基因植株, 平均转化频率为1.7%(按GUS+愈伤组织数计算)和1.9%(按再生转基因植株 数计算),但不同品种间存在明显差异。 (4)整株存活试验表明,在相同的高盐与高渗胁迫下,转基因植株具有明 显的生长优势,植株存活率分别达65.7%和71.4%,高于非转化对照植株的28.6% 和42.9%。经低温、高温、干旱和高盐等逆境胁迫处理后的叶片相对电导率测定 结果显示,转基因植株的相对电导率平均较非转化对照植株低20%一30%。这些 事实说明,CBFI基因的组成型表达使高羊茅转基因植株的耐逆性得到了增强。 考察表明,在正常环境条件下,转基因植株的生长受到了一定抑制。对1个Tl 代转基因株系进行PCR检测后发现,外源基因已传递至后代,但发生了严重的 偏分离。 (5)作为本论文的相关研究内容,从高羊茅基因组中克隆出1个608bP的 C刀尸同源基因片段,该片段与3个拟南芥 CBF基因的核昔酸及其推导氨基酸序 列分别具有81%一84%和75%一79%的同源性,而且推导氨基酸序列中包含有同源 性更高的APZ DNA结合域以及为CBF蛋白独有的两段特征序列 PKK/RRAGRxKFxETRHP和DSAWR。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:Q943

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10 佘建明;张保龙;陈志一;倪万潮;;草坪型高羊茅成熟种子离体培养植株再生技术研究[A];全国作物细胞工程与分子技术育种学术研讨会论文集[C];2003年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 百绿;“凌志”高羊茅[N];中国花卉报;2005年
2 百绿;根茎型高羊茅[N];中国花卉报;2005年
3 刘永刚;高羊茅的特征及品种[N];中国绿色时报;2000年
4 程霞;强劲高羊茅[N];中国花卉报;2004年
5 ;优质牧草V16高羊茅[N];瓜果蔬菜报.农业信息周刊;2005年
6 施鼎康;高羊茅锈病[N];中国花卉报;2004年
7 浙江东阳 韦俊良;浙中地区高羊茅病害综合防治[N];中国花卉报;2006年
8 龚万柏;高羊茅草坪病害综合防治(下)[N];中国花卉报;2004年
9 寿晓婷;绿化小草被“调包”了吗?[N];江苏法制报;2005年
10 张吉献;高羊茅草坪的栽植管理[N];中国花卉报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 吴关庭;农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立及CBF耐逆相关基因的导入[D];浙江大学;2004年
2 于景金;高浓度CO_2下高羊茅应对温度和水分变化的生理生化响应及其机理[D];北京林业大学;2012年
3 钱海丰;转CryIAc和CpTi基因水稻抗虫性比较及高羊茅植株再生[D];浙江大学;2003年
4 尹淑萍;草莓栽培品种离体再生及遗传转化的研究[D];中国农业大学;2004年
5 韩凝;植物螯合肽及植物螯合肽合成酶在植物镉耐性和积累中的作用机制研究[D];浙江大学;2005年
6 乔卫华;长穗偃麦草Na~+/H~+反向转运蛋白基因的分离与功能分析[D];山东农业大学;2006年
7 王月华;结缕草GA20氧化酶基因的克隆及遗传转化研究[D];北京林业大学;2007年
8 何亚丽;冷季型草坪草耐热基因型的选育和水杨酸调控耐热性的机理[D];南京农业大学;2002年
9 贾亚雄;盐草(Distichlis spicata)耐盐生理及Na~+转运机理研究[D];中国农业科学院;2008年
10 蔡云飞;植物远缘体细胞杂种的核/质基因组组成及其代谢转录组研究[D];山东大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 谢苑;白三叶水浸液对高羊茅化感作用的物候规律研究[D];四川农业大学;2008年
2 徐峰;植被护坡处理苏州古城区径流污染物模拟试验研究[D];河海大学;2005年
3 杨帆;高羊茅(Festuca arundinacea Shreb.)胚性悬浮系的建立及原生质体分离研究[D];北京林业大学;2009年
4 蒋金平;草坪草种子生产技术研究[D];甘肃农业大学;2001年
5 王健;1.高羊茅高频再生体系的建立和基因枪法介导的遗传转化研究 2.高羊茅几丁质酶基因Ⅰ保守片段的克隆及其序列分析[D];西北大学;2006年
6 张晓娟;高羊茅内生真菌的分离、鉴定及其生物防治的初步研究[D];四川大学;2006年
7 孙敬先;模拟鸟巢式运动场的热集聚效应及其对高羊茅草坪生长的影响[D];甘肃农业大学;2006年
8 王玉刚;三种草坪草抗旱性研究[D];新疆农业大学;2004年
9 刘连斌;狗牙根运动场草坪复播高羊茅技术及种间竞争力的研究[D];南京农业大学;2007年
10 徐国荣;转ZmPIS基因提高高羊茅耐旱耐盐性研究[D];山东大学;2008年
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