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《浙江大学》 2004年
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加压CO_2-乙醇-水体系等电沉淀蛋白质过程的研究

齐祥明  
【摘要】:以高附加值蛋白质的分离、纯化为背景,在新近兴起的加压CO_2-水溶液体系等电沉淀技术的基础上,引入助沉淀剂——乙醇,形成加压CO_2-乙醇-水溶液体系沉淀蛋白质技术。该方法具有环境友好、过程可控性强等特点,符合生物分离技术的发展趋势,具有潜在的实用价值。 首先,以碱性蛋白酶2709~#粗品为对象初步考察了加压CO_2-乙醇-水溶液体系沉淀蛋白质技术的可行性和规律。结果表明,用该技术可以实现对碱性蛋白酶2709~#粗品的除杂。体系pH值较低时,会出现酶分解的现象,但通过控制操作条件可保持酶的相对稳定。CO_2压力、酶液的初始pH值、酶浓度和乙醇含量会影响溶液pH的变化和沉淀现象;操作温度对其影响不大。处理时间、CO_2压力、酶液的初始pH值、酶浓度、乙醇含量等参数会影响操作过程中蛋白质的稳定性。 第二,通过考察温度、初始pH值、乙醇含量三个参数对加压CO_2-乙醇-水三元体系的影响得知,温度、乙醇浓度对体系pH值随压力变化情况影响不大。用简化的液相pH计算模型对加压CO_2-乙醇-水三元体系液相pH进行分析,结果表明,乙醇降低了液相中CO_2和水的活度,揭示了乙醇促进CO_2的溶解但对体系pH值随压力变化情况影响不大的原因。不同浓度的乙醇水溶液在加压CO_2条件下的体积膨胀结果表明,当乙醇含量不超过30%时,体积膨胀现象及其微弱。这表明蛋白质在这样的体系中沉淀时,加压CO_2的抗溶剂效应很小。 第三,通过对BSA、溶菌酶在加压CO_2-乙醇-水体系中的沉淀情况和液相pH变化情况考察发现:BSA会在等电点附近沉淀出来,并在溶液pH进一步降低时返溶;实验考察范围达不到溶菌酶的等电点11.0,溶菌酶不沉淀,而溶菌酶粗品中等电点在5左右的杂蛋白可以沉淀出来。这表明体系中的沉淀作用主要是等电沉淀,在实验考察范围内加压CO_2抗溶剂沉淀作用不明显。 第四,乙醇具有助沉淀的作用。蛋白质分子结构数据表明,乙醇还在一定程度上改变了蛋白质分子的表面结构,这影响到了蛋白质的缓冲能力等特性,从而乙醇对加压CO_2-乙醇-水-蛋白质多元体系的pH变化有降低的作用,这使体系可处理的蛋白质浓度较加压CO_2-水-蛋白质体系大幅度提高。而在实验考察的乙醇浓度范围内,这种结构的变化是可逆的,对生物质活性的影响不大。对于加压CO_2-乙醇-水-蛋白质多元体系,入釜前pH的调节能起到改变pH的可调范围和 浙江大学博士学位论文 提高pH控制精度的作用。 第五,蛋白质所具有的缓冲能力使含蛋白质的多元溶液体系较不含蛋白质的 三元溶液体系在相同的COZ压力下pH值有所提高,通过计算发现对于不同的 CO:压力,这种pH值的增高比率近似为一常数。乙醇的加入,降低了蛋白质的 缓冲能力,这一常数也有所下降。将这一规律与简化的pH计算模型结合起来, 可使加压COZ一乙醇一水一蛋白质多元体系中的PH值预测大大简化,因而对于含蛋 白质溶液的 pH计算和该技术在工程上的应用将非常有意义。 第六,综合四种酶类(碱性蛋白酶、溶菌酶、纤维素酶、好激酶)的研究结 果发现,不同酶类在体系中稳定性有所差异,但各操作条件对稳定性的影响作用 是相似的。温度、乙醇含量的增高对蛋白质稳定性有不利的影响;而增加溶液中 酶浓度有增加酶的稳定性的作用。一般而言,在适当的操作范围内都能使酶保持 相对稳定(相对酶活保持在80%以上)而同时得到较好的沉淀效果。对纤维素 酶和叫激酶粗品进行了初步分离实验,在实验考察范围内的最佳操作条件下得到 了令人满意的结果。对于纤维素粗酶,可将绝大部分CMC酶沉淀出来;而对于 妇激酶可将其他杂蛋白沉淀出来。 总的来说,加压COZ一乙醇一水溶液沉淀蛋白质技术具有诸多优点和良好的发 展前景,而本文从理论和应用两方面对这一过程进行了有益探讨,希望能对该过 程的发展起到推动作用。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:O629

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