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温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶协助蛋白质体外复性的基础研究

崔志芳  
【摘要】:目前,蛋白质体外重折叠复性技术已成为制约生物工程技术产业化的瓶颈问题。开发新型、高效,同时又易于操作、回收的蛋白质体外复性添加剂成为近年来的研究热点。为此,本文在对多种复性方法进行比较的基础上,探讨了用凝胶作为复性添加剂的方法。选择温敏型聚N—异丙基丙烯酰胺(PNIPA)凝胶作为研究对象,研究了该凝胶对溶菌酶和重组牛凝血酶原-2(pThr-2)包涵体蛋白体外重折叠复性的协助作用。 采用水溶液聚合法,以N-异丙基丙烯酰胺为单体,N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)作为交联剂,过硫酸铵作为氧化剂,N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作为加速剂合成块状PNIPA凝胶,温敏性能及溶胀特性的研究表明其低临界溶解温度(LCST)为33℃,溶胀及缩水平衡所需时间为24h。在稀释复性溶菌酶的基础上,添加PNIPA块状凝胶,复性24h后溶菌酶的比活为7012.3 U/mg,提高了40%以上。 以液体石蜡为连续相,Tween80为分散剂,采用反相悬浮法制得具有快速响应特性的PNIPA粒状凝胶,温敏性能研究表明其LCST与块状PNIPA凝胶相同,均为33℃,与块状凝胶相比,由于具有更大的比表面积,对温度具有更快的响应特性,在3min内即可达到溶胀及缩水平衡。显微镜及扫描电镜照片表明,该凝胶粒子的直径在0.2-0.5mm之间,表面分布着直径为1-2μm的微孔。随着交联度的升高,凝胶内部的孔洞形成相连的结构。粒状PNIPA凝胶用于溶菌酶复性时,最佳温度为30℃,转速120rpm。加入80mg/mL PNIPA粒状凝胶3h后可使溶菌酶的活力回收率由稀释复性时的45.03%提高到76.52%,其比活可达8417.4U/mg。不同稀释倍数下PNIPA凝胶协助复性的效果表明:溶菌酶浓度越高,与稀释复性相比凝胶协助复性的效果就越好。不同组成的凝胶协助溶菌酶复性的结果表明:交联度及总单体浓度越高的凝胶,其协助复性的效果就越好。凝胶重复利用8次后溶菌酶的活力回收率为54.98%,仍高出稀释复性22%以上。 在提出变性蛋白质体外复性过程的动力学模型及对模型方程求解的基础上,采用Statistica6.0软件对模型方程与溶菌酶复性的实验数据进行了拟合,动力学模型能够较好地描述凝胶协助溶菌酶的体外复性过程。复性液中添加PNIPA粒状凝胶后使得速率常数k_2(正确折叠)和k_3(错误折叠)的值减小,复性时间延长,但却增加了两者的比值(k_2/k_3),说明PNIPA凝胶作为一种协助复性的添加剂,对聚集反应具有更强的抑制作用,这就部分解释了PNIPA凝胶能够促进溶菌酶复性的机理。 采用单因素实验方法,对含有pThr-2质粒的重组大肠杆菌的发酵条件如: 浙江大学博士学位论文 摘要 发酵培养基的成分、诱导剂IPTG的添加量、接种量、温度及摇床转速等进行了 优化,每升发酵液可获得pThr.2包涵体110mg,比优化前的产量提高了40%。 优化后的包涵体最佳洗涤液中含有10~ol/L EDTA、2.5 mol/L尿素、0.7%(w/w) 肠11onX一1 00。 采用一次正交回归试验及快速登高试验,综合考察了pThr.2包涵体体外重 折叠复性的关键参数,包括GSSG浓度及GSSG/GSHt匕例,Urea浓度,PEG6000 浓度,L~Arg添加量以及复性温度等。实验结果表明,当复性缓冲液中GSSG浓 度为o.6mmol几,GSSG/GSH为0.9,尿素浓度为2.7mol几,PEG600O浓度为0.1 %,L一Arg添加量为0.5 mol几时,室温下复性能够得到较好的结果,激活后的 凝血酶活力可达2948U/mL。加入凝胶协助复性后凝血酶活力可达6222U/mL, 最佳添加量为105mg/mL,稀释倍数越低,凝胶协助复性的效果就越明显,且与 凝胶协助溶菌酶复性相似,PNIRA凝胶的加入在协助复性的同时,也在一定程度 上延长了复性达到平衡所需的时间。溶菌酶体外复性动力学模型用于重组牛凝血 酶原一2包涵体蛋白的体外复性时,模型与实验数据拟合较好,说明可以借鉴于相 对成熟的溶菌酶体外复性技术,深入探讨pThr-2的体外复性,为进一步提高其 复性收率打下良好的基础。同时也进一步验证了PNIPA凝胶协助复性主要是通 过抑制蛋白质相互间的聚集反应来实现的。 最终凝血酶经肝素亲合柱纯化后,每升发酵液可得到1.2mg具有活性的凝血 酶。荧光光谱分析表明复性后得到的凝血酶具有与天然态凝血酶相同的最大荧光 发射波长。 PMPA温敏型凝胶作为一种新型、高效的协助蛋白质复性的添加剂,变性蛋 白在迅速进入凝胶的网孔结构内部后,与其疏水侧链发生疏水相互作用,在抑制 蛋白质相互间聚集沉淀的同时,提高了蛋白质的复性收率。该凝胶易于回收,可 简化复性操作,节省复性成本,从而在蛋白质复性领域有着广泛的应用前景。


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