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《浙江大学》 2004年
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以离子交换法为核心典型胞外(米多霉素)和胞内(S-腺苷甲硫氨酸)产物制备技术的研究

陈勇  
【摘要】:细胞培养产物可以分为胞外和胞内产物两大类,它们的分离纯化工艺具有不同的特点。本论文以胞外产物米多霉素(Mildiomycin,MIL)和胞内产物S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)的分离纯化为研究对象,建立了以离子交换技术为核心的高效、低污染的分离纯化工艺,在实验室和中试规模获得了符合质量要求的产品。 米多霉素是由龟裂链轮丝菌(Streptoverticillium rimofaciens)发酵时分泌到胞外的一种新型核苷类农用抗生素,具有对真菌,特别是植物白粉病专一性高、抑制作用强烈、作用剂量小、环境相容性好、对人体及动物的毒副作用非常小等特点,是一种绿色环保的生物农药。S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)是体内关键的代谢中间物质,参与甲基化反应、转硫反应、聚胺合成反应,具有多种重要的生理功能,对关节炎、各种肝病、抑郁症等有很好的疗效。SAM是胞内产物,可以通过在酵母培养体系中添加前体L-甲硫氨酸促进其在酵母细胞内积累。根据MIL和SAM的不同特点,需要建立不同的分离纯化策略,同时MIL和SAM又具有水溶性、离子型、小分子化合物的共性,可以采用以离子交换法为核心的分离纯化工艺。 1.从发酵液中分离提纯米多霉素 建立了从发酵液中分离纯化米多霉素的优化工艺路线,包括如下主要步骤:发酵液预处理、HZ011树脂吸附、D296大孔强碱树脂脱色、001×16高交联度凝胶强酸树脂脱盐以及HD—2树脂精制等过程,实现了米多霉素的高收率、高纯度的分离纯化。 该工艺的特点是:1) 采用草酸酸化沉淀法对MIL发酵液进行预处理。草酸沉淀的优点是能够同时除去发酵液中的酸性蛋白和钙、镁离子,增大了米多霉素在阳离子交换树脂上的交换容量,同时沉淀的酸性蛋白能起到助滤剂的作用,有利于菌丝体的过滤,提高MIL在预处理步骤中的收率;2) 根据MIL具有较强碱性的特点,选择了既具有较高交换容量、产物又能很容易被洗脱的弱酸性阳离子交换树脂HZ011从发酵液中分离MIL,进行了温度、pH值、MIL浓度、流速及洗脱条件等因素对离子交换等温线和离子交换动力学影响的基础研究,优化了操作条件,使MIL在该步骤的回收率达到了94.5%;3) 建立并优化了采用D296树脂脱除色素的同时制备MIL不同阴离子盐的工艺。脱色率和MIL回收率分别达到了97.2%和95.4%;4) 采用001×16树脂脱盐和弱酸性层析树脂HD—2进行MIL精制,脱除无机盐和米多霉素类似物后的最终产品中MIL纯度达到了95%以上。 利用元素分析、HPLC、紫外吸收光谱、红外吸收光谱、核磁共振和质谱等 浙江大学博士学位论文 摘要 现代分析技术确证了米多霉素的化学式和分子结构。制备了5.5%米多霉素可溶 性粉剂用于室内生物活性测定和安全性评价。对黄瓜白粉病的防治结果表明,米 多霉素的药效明显高于同类产品三哇酮,Ecg。为51 .77m留1。原药及制剂的急性 毒性实验结果表明米多霉素完全符合安全性要求,对人畜无毒。考察了米多霉素 水溶液和固体粉末的热贮稳定性(5牡2℃,时间为两周),结果表明米多霉素水 剂不稳定,粉剂的稳定性很好,有效成分分解率小于3%。 对实验室研究开发的米多霉素分离纯化工艺进行了中试放大,完成了2.5M3 米多霉素发酵液分离纯化中试试验,结果表明,所建立的分离提纯工艺稳定,产 品收率和纯度均达到了实验室水平。 2.从酵母细胞中分离提纯S一腺着一L一蛋氨酸(SAM) 研究了SAM的稳定性问题,考察了SAM在不同温度及pH值时的降解速率, 为防止SAM在分离纯化过程中的降解损失提供了理论指导。 建立了从发酵液中分离提纯SAM优化的工艺路线,包括如下主要步骤:从 酵母细胞中萃取SAM、利用HZ0n树脂从萃取液中分离SAM、反向盐析法制 备SAM的硫酸盐、SAM硫酸及对甲苯磺酸双盐和SAMI,4一丁二磺酸盐制备等。 该工艺路线的特点是:l)采用先加50%乙酸乙酷水溶液,剧烈搅拌处理30 分钟,然后加入0,35NHZSO4处理1.5小时的工艺从酵母细胞中抽提SAM,实现 了在酵母细胞基本完整的情况下高效率抽提胞内产物,避免了胞内物质的大量泄 漏,有利于后续分离纯化的顺利进行,提取率90%以上;2)通过对离子交换树 脂的筛选,获得了对SAM有良好分离作用的HZOH树脂;在对SAM在HZOn 树脂上离子交换平衡、动力学和固定床动态过程等研究的基础上,优化了离子交 换分离SAM的工艺条件,SAM的回收率达到%2%;3)建立了反向盐析法提 纯并制备SAM硫酸盐的方法,大幅度提高了SAM硫酸盐结晶的收率和纯度, 所得产品收率为943%,纯度92%;4)完善了SAM硫酸对甲苯磺酸双盐的结 晶工艺,研究开发了利用离子交换法生产SAMI,4一丁二磺酸盐的制备工艺。 通过水分测定、元素分析和质谱等现代分析手段,确证了三种SAM磺酸盐 的化学式分别为:sAM硫酸盐,sAM+·Hs伽一250;·1 .5(H2O);sAM硫酸对甲 苯磺酸双盐,sAM+·HSo4一HZsO4·(eH3C6氏so3H)·HZo;SAMz,4一丁二磺 酸盐,SAM·1 .5(1,4一丁二磺酸盐),并对三种产品制定了较为详细的质量标准。 考察了三种SAM磺酸盐的热稳定性,结果表明SAM硫酸对甲苯磺酸双盐和1,4 一丁二磺酸盐的热稳定性均优于硫酸盐,这两种磺酸盐在室温下都很稳定,45℃, 60天内有效
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:TQ920

【引证文献】
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