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青蒿素类药物抗血管生成作用及其对血管内皮生长因子和受体表达的影响

陈欢欢  
【摘要】:血管生成(angiogenesiS)是指已存在的血管(毛细血管和小静脉)通过出芽或分裂的方式产生新的血管。生理与病理条件下,如胚胎发生,女性生殖周期、炎症反应、伤口愈合、肿瘤发生等过程都进行着血管生成。特别是病理条件下,据统计,大约20~40种人类疾病与血管生成的上调或下调有关。尤其是肿瘤,肿瘤组织的快速生长必须伴有新生血管渗入,以保证营养的供应,从而维持肿瘤细胞的旺盛代谢;同时新生血管又为肿瘤细胞离开原发病灶,通过血液转移创造了有利的条件。如果能够有效地抑制肿瘤血管的生成,无疑将为肿瘤的治疗开辟一片新天地,因此抗血管生成疗法已成为了治疗肿瘤的新策略。研制开发血管生成抑制剂(angiogenesis inhibitor)已成为当今医药界新的研究热点。 青蒿素(artemisinin)是由我国学者从植物黄花蒿Artemisia annua Linn中提取的新一代高效低毒抗疟药。青蒿琥酯(artesunate)是青蒿素的水溶性衍生物,为二氢青蒿素(dihydroartemisinin)的12-a-琥珀酸酯钠。而二氢青蒿素为青蒿素类药物的体内主要代谢物。这类药物除了其特殊显著的抗疟疗效外,还具有抗血吸虫及其他寄生虫,免疫调节等作用。近年来已有较多的文献报道青蒿素及其衍生物青蒿琥酯、二氢青蒿素等具有较强的抗肿瘤活性。但对于其是否同时具有抑制血管生成的作用,尚未见报道。本论文采用人卵巢癌裸鼠移植瘤模型和免疫组化法研究青蒿素类药物的体内抗血管生成作用;采用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的生长,迁移及小管形成模型研究药物的体外抗血管生成作用,用ELISA检测试剂盒测定肿瘤细胞释放的VEGF的水平和用免疫组 浙江大学硕士论文 化法检测HUVEC细胞上vEGF受体表达.对青篙素类药物的抗血管生成作用进行了药效和机制 的探讨,为进一步开拓其应用提供药理依据。 1青篙唬醋整体抑制血管生成 对裸鼠肿瘤血管密度的影响 在人卵巢癌裸鼠移植瘤动物模型中,青篙玻酷高剂量组(loom叭g吐),中剂量组(50m叭g吐) 和低剂量组(lom叭g·d)肌肉注射治疗后,肿瘤组织血管密度分别为11.6士4.犯、27.75士8.04、 47.92士11.49,生理盐水对照组为48.98士9.04。高、中剂量组血管计数均明显少于生理盐水对照 组,低剂量组与对照组相比较无明显差异。 2裸鼠肿瘤体积变化及药物的毒副作用 用药过程中,治疗组肿瘤生长慢于对照组。巧天用药后,高、中剂量组肿瘤体积均小于对 照组。用药期间,四组荷瘤裸鼠活动良好,未见特殊不良反应,无一例死亡。用药巧天后对照组 的平均去瘤鼠重与对照组比较无显著差异。 3对肿瘤组织中VEGF及其受体KD侧nk一1蛋白表达的影响 治疗组与生理盐水对照组vEGF,KD侧fik一1受体在肿瘤细胞和血管细胞中表达情况如Fig4, rigs。高剂量组(1 00 mg kg一’d一,),中剂量组(50 mg kg一’d一’)和低剂量组(1 0 mg kg’d一’)vEGF, KO侧flk一l免疫组化染色阳性率与对照组相比较均有明显差异(P005),见Tabl。 2青篙唬醋和二氢青篙素体外抑制血管生成 2.1体外抑制血管内皮细胞(HUVEC)增殖 体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUvEC),用青篙城酷或二氢青篙素处理48小时,其生长 被明显抑制,用MTT法检测,OD值下降呈量效关系。青篙唬酌和二氢青篙素抑制HUvEC生长 浙江大学硕士论文 的ICS。值分别为20.7士3.2叫和11.4士3.8附,二氢青篙素的抑制能力比青篙玻酷强。 2.2抑制HUVEC的迁移 细胞迁移实验结果表明,在药物作用下,血管内皮细胞迁移进入受伤裸露区的数量明显减少。 青篙唬酷和二氢青篙素在0.5“M浓度就能显著地抑制HUVEC的迁移,抑制程度随着药物浓度的 加大而增强。当药物浓度达到50卜M时,可以抑制HUVEC迁移达90%以上。二氢青篙素的抑制 作用比青篙玻酷强。 2.3抑制HUVEC的小管成型 HUVEC在胶原凝胶基质中生长2一3天时,细胞由原来的多角形变成长梭形,并向凝胶基质 中延伸生长,呈线形排列而形成管状结构,多个管状结构连接形成三维网状结构.在药物作用48 小时后,显微视野中小管总长度减小。当青篙唬醋浓度为2.5叫,二氢青篙素的浓度为0.5叫时, 对HUVEC的小管形成即有明显的抑制作用,二氢青篙素的浓度为50林M时,对HUVEC的小管 形成抑制达到90%。 2.4降低VEGF与受体结合的活力 与VEGF结合的HUVE细胞经0.5%Tritonx一100充分裂解后,用ELISA检测试剂盒测定裂 解液中VEGF的量。实验结果表明:0.5叫的青篙唬酷和0.1闪的二氢青篙素就能明显降低VEGF 与受体结合的量。 2.5抑制HUVEC上VEGF受体的表达 以免疫组织化学结合图像分析的方法检测HuvEc细胞上受体Flt一l和受体KD侧flk-1蛋白 的表达。用蛋白染色后的积分光密度值(IA)来半定量蛋白的表达。青篙唬酷和二氢青篙素在 0.1囚时均能明显抑制Flt一1和KD刃flk一1的表达,且二氢青篙素的作用比青篙唬酷显著. 浙江大学硕士论文 3.抑制肿瘤细胞的增殖和VEGF分泌 3.1抑制肿瘤细胞增殖 用MTT法测试了青篙玻酷和二氢青篙素对肿瘤细胞和正常对照细胞的生长抑制作用。青篙 唬酷对三种肿瘤细胞:人宫颈癌Hela细胞、人子宫绒毛膜癌JAR细胞和人卵巢癌HO一8910细胞 的生长抑制ICS。值范围为38一50卜M,而二?


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