地非三唑在鼠肝微粒体中的体外代谢以及对细胞色素P450的体内诱导和体外抑制作用

【摘要】：药物代谢和生物转化的途径多种多样，包括氧化反应、还原反应、水解反应、缩合反应和结合反应等，研究这些途径可以阐明药物的作用机理，了解药物是否会发生药理或毒理作用。药物代谢一般可以分为两相：即通常所说的一相代谢(或称官能团化反应)和二相代谢(或称结合反应)。 细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)是参与众多外源物和内源物在体内代谢失活／活化的重要酶系，主要存在于肝微粒体中。CYP催化外源物的代谢具有范围广、专一性差、结构差别大、个体差异大、催化底物有交叉重叠性以及易受诱导和抑制等特点。在药物代谢过程中往往存在一种CYP亚族参与多个药物代谢、一种药物由多个CYP亚族催化代谢的现象。同时，许多药物既是某种药酶的底物，也可能是该种酶或其他酶的诱导剂或抑制剂，当多种药物联合用药时，有可能导致其中一种药物发生代谢障碍或加快代谢速度，使发生毒副反应或药物无效。药物相互作用的研究已受到了FDA的重视，并于1997年公布了相应的指导性文件。目前国际制药企业普遍加强了对新药的吸收、分布、代谢、排泄和毒性的研究，在创新药物的早期研究阶段进行安全性评价，以减少新药开发的风险，提高研发成功率。 地非三哗(diphenytriazol)是一种非甾体、非前列腺素类候选药物，具有终止早孕和体外抑制人体卵巢癌细胞的作用，其终止早孕作用强、毒性低、安全界广，可能具有较好的临床前景。本文采用鼠肝微粒体体外孵育法来研究地非三唑与CYP之间的相互作用，为其今后临床安全、合理、有效应用，避免或减少不良反应发生，提供科学依据。全文通过四个方面来阐明CYP对地非三唑体外代谢的介导作用，地非三唑对CYP的诱导和抑制作用，以及地非三唑与有关药物在CYP代谢水平上的相互作用。 浙江大学硕j学位论文 药学院药物分析专业胡云珍 1.地非三哇在鼠肝微粒体中的体外代谢 目的:了解地非三畔的体外一相代谢主要受何种酶介导，为其临床合理应用和进 一步开发利用提供科学依据。方法:建立鼠肝微粒体中地非三哇的反相高效液相 色谱测定法(砂一HPLC)，并对地非三吟在不同诱导剂〔p一蔡黄酮(BNF)、苯巴比 妥(PB)、地塞米松(Dex)、地非三哇和空白对照)处理的鼠肝微粒体中的代谢 进行了研究。将地非三哇与各种鼠肝微粒体进行体外共孵育，用氯仿终止反应， 以地西浮为内标，RP一HPLC测定孵育后剩余的地非三哇的量。结果:地非三哇 在3.62一362.0卜mol.L-’浓度范围内呈良好的线性关系。测得平均萃取回收率和方 法回收率为(91.7士5.0)%和(100.7士】.9)%(n=6)。日内精密度2 .5%;日间精 密度3.6%(n=5)。检测限为0.36娜01·L一’(s加二3)，定量限为1.79林mol·L‘’(Rsn 6.3%，n二3)。BNF诱导和地非三哇处理的鼠肝微粒体对地非三哇代谢具有很强的 催化活性，Dex和PB诱导组也有一定的催化能力，两者均强于空白对照组。在 鼠肝微粒体中孵育20min后，BNF组、地非三哇组、Dex组、PB组中地非三哇 的量分别减少了59%，62.4%，31.5%和25%，而空白组仅代谢了10.8%。测得 地非三畔在空白、BNF诱导以及地非三哇处理的微粒体中的Km和Vmax分别为 77名1士4 .73，41.76士3.26，45.17士6.06林mol·L一，和3.087士0.202，x5.34士1.03， 17.54士1 .79nlnol/mi可mg。BNF组和地非三噢组具有相似的Km和vmax值，与空白 组均有显著差异(p0 .01)。HPLC一Ms测定结果显示地非三哇的代谢途径主要为 羚化反应和脱甲基反应。CYPIA的特异性抑制剂氟伏沙明能显著抑制地非三哇 在未经诱导剂处理的微粒体中的代谢。结论:由BNF诱导的鼠肝微粒体 (、CYP IA)在地非三哇的体外代谢中起了主导作用;Dex诱导的鼠肝微粒体 (CYP3A)和PB诱导的鼠肝微粒体(主要为CYPZB和CYP3A)则部分参与。 地非三咪处理的鼠肝微粒体对其自身的代谢也起重要作用。 2.地非三哇对CYP的体内诱导作用 目的:本实验通过用相同剂量地非三吟油溶液对大鼠进行不同天数的腹腔注射， 观察地非三哩对鼠肝微粒体中CYP的诱导作用。方法:l)用CYPIA、CYPZB 的两种特征性底物乙氧基异吩恶吟与7一戊氧基异吩恶吟在经不同天数地非三吟 处理的鼠肝微粒体中代谢，用荧光仪在激发波长(ex)565nm，发射波长(em)587nln 下直接测定代谢物异吩恶吟的生成量。从而测定乙氧基异吩恶吟一脱甲基酶 浙江大学硕卜学位论文 药学院药物分析专业胡云珍 (EROD)与7一戊氧基异吩恶哇一脱烷基酶(PROD)的含量，用来表征微粒体中 CYPIA与CYPZB的活性。2)分别用CYPIA、CYPZB、CYP3A的特征性底物 非那西丁、氨基比林、地西伴与经不同天数地非三畔处理的鼠肝微粒体体外共孵 育，用氯仿终止反应并提取剩余底物，用RP一HPLC内标法选用不同的色谱条件 分别测定剩余底物浓度。3)选用CYPIA的抑制剂氟伏沙明、a一蔡黄酮等对非那 西丁代谢进行抑制试验。结果:l)不同天数地非三哇处理的鼠肝微粒体中EROD 的含量比空白对照组有明显的增加(p0 .01)，而且与诱导天数有良好的相关性 (r0 .99)。而PROD的含量在地非三畔组与空白组之间无明显差异(p0.05)。2) 非那西丁在不同天数地非三畔处理的鼠肝微粒体中有很强的代谢，代谢程度与诱 导的天数有很好的相关性;CYPI