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《浙江大学》 2004年
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表达β-半乳糖苷酶的galB16肿瘤模型的建立及其在抗肿瘤免疫研究中的初步应用

金国祥  
【摘要】:本论文的主要工作是建立一个以β-半乳糖苷酶为标志性抗原的小鼠黑色素瘤模型—galB16肿瘤模型。并且在模型成功建立后,运用β-半乳糖苷酶表达载体作为DNA疫苗,在galB16肿瘤模型上进行了初步的抗肿瘤免疫方法的研究。研究工作可以分为几个部分:构建携带β-半乳糖苷酶编码基因的真核表达载体p3gal;p3gal载体稳定转染B16小鼠黑色素瘤细胞,获得稳定表达β-半乳糖苷酶的galB16细胞;建立表达β-半乳糖苷酶的小鼠galB16肿瘤模型;用免疫方法抑制galB16肿瘤生长的动物实验。 首先通过HindⅢ和BamHI限制性内切酶双酶切从Promega公司的质粒pSV-β-Galactosidase control vector上切下完整的β-半乳糖苷酶编码基因,插入到真核表达载体pcDNA3多克隆位点的HindⅢ和BamHI酶切位点之间,得到重组载体p3gal。经过酶切和测序鉴定后,按照Qiagen质粒纯化试剂盒提供的方法抽提p3gal,以Qiagen质粒纯化柱纯化后,瞬时转染小鼠黑色素瘤B16细胞,48小时后X-Gal细胞染色结果显示有细胞呈蓝色,即表达β-半乳糖苷酶。从功能上验证了构建的p3gal载体含有能够在真核细胞中表达的β-半乳糖苷酶编码基因。 进一步用纯化的p3gal表达载体稳定转染B16细胞。通过G418压力筛选来得到稳定转染了外源基因的单细胞克隆。然后对得到的各个单细胞克隆进行X—Gal细胞染色鉴定,表达β-半乳糖苷酶的细胞将呈蓝色,很容易在光学显微镜下区别出来。通过这种方法,我们获得了能够表达β-半乳糖苷酶的galB16细胞株。 表达β-半乳糖苷酶的galB16细胞株继续在G418压力下培养,到足够的细胞量后接种到C57小鼠背部皮下,成功地建立了肿瘤模型。取肿瘤抽提基因组DNA用β-半乳糖苷酶基因引物从基因水平上进行PCR扩增鉴定,鉴定结果表明所建立的肿瘤基因组中含有β-半乳糖苷酶编码基因片断。然后取肿瘤组织做10 μm冰冻切片,对切片进行X—Gal组织染色鉴定,结果肿瘤组织切片可以染成蓝色。从功能水平上证明所建立的肿瘤模型表达β-半乳糖苷酶。至此,以β-半乳糖苷酶为肿瘤标志性抗原的小鼠黑色素瘤模型—galB16肿瘤模型成功地建立 浙江大学硕士学术论文 了。 成功建立表达p一半乳糖昔酶的小鼠ga1B16肿瘤模型后,后续工作就是在该 模型上,针对p一半乳糖普酶设计免疫疫苗的抗肿瘤免疫方法的研究。在本论文 中,我们也设计了一组动物实验初步观察了以p一半乳糖普酶表达载体作为DNA 疫苗进行抗肿瘤免疫的效果。实验分为四组,分别采用以下方案免疫小鼠:l) 注射生理盐水作对照;2)注射DNA疫苗即p3gal表达载体(IOOp留小鼠);3) 注射免疫佐剂CpG 1826(ZOp留小鼠);4)同时注射DNA疫苗和免疫佐剂。实验 结果显示队半乳糖营酶表达载体作为DNA疫苗可以抑制galB 16肿瘤的生长, 免疫佐剂CpG 1826能够增强ONA疫苗的作用。这一结果表明,我们可以把p- 半乳糖营酶当作galB 16肿瘤的内源性抗原,在这一模型上进行针对p一半乳糖昔 酶肿瘤抗原的抗肿瘤免疫的研究,主要是抗肿瘤免疫方法的探索、新型抗肿瘤免 疫佐剂的鉴定等。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R730.3

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