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《浙江大学》 2004年
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石斛类ISSR标记研究与ITS序列分析

沈颖  
【摘要】:本文对石斛属植物基因组DNA的提取方法进行了优化,建立了适合石斛属PCR扩增所需的基因组DNA提取方法。首次将ISSR标记应用于石斛属内的种质鉴定研究,建立了适合石斛属ISSR-PCR的方法,并优化了PCR反应条件。采用ISSR标记对石斛属12个种以及铁皮石斛8个居群进行了鉴别和区分。对于铁皮石斛特有的一些扩增片段,进行了测序分析。另外,采用ITS区域测序的方法,确定了浙江富阳野生种铁皮石斛的种质。结果表明: 1.采用改良的CTAB法成功地提取了石斛这一多糖含量较高的植物基因组DNA,该方法目前已被本实验室广泛采用,提取的DNA纯度和质量均较高。所提的DNA完全可以用于ISSR-PCR反应要求。 2.石斛属ISSR-PCR反应优化后合适的反应体系为:25 μL反应体系中含有约50 ng模板DNA,1 μM引物,2.0 mM Mg~(2+),200 μM dNTP,2%去离子甲酰胺以及1单位Taq酶。反应参数为:94℃预变性7 min;94℃变性30 sec,52℃复性45 sec,72℃延伸2 min,循环45次;72℃延伸7 min,最后PCR产物保存在4℃中。按照优化后的条件进行重复实验,获得结果重复性好,电泳图谱清晰。 3.除P1以外,其余21条引物均可以不同程度地产生扩增片段。对于12种石斛,13条引物有较好的扩增模式,共产生了144个扩增条带。其中8条引物产生了109个扩增条带,且全部是多态性条带。这说明,在不同种石斛之间,由ISSR-PCR检测获得的多态性水平是相当高的。引物P9、S7、S8、S9、S10均可以独立区分所有被测的12种石斛。 4.对于8个居群的铁皮石斛,选用5条引物进行区分。4条引物产生了47个扩增条带,其中42个是多态性的,多态性比率达到89.4%。另外一条引物没有多态性条带,但所有铁皮石斛在700 bp都有一条清晰明亮的扩增条带,而其他种石斛则与之在片段大小上略有差异。引物S9、S10均可以独立区分所有被测的8个居群的铁皮石斛。 5.ISSR-PCR扩增结果表明,福建、湖南一带开紫红色花的铁皮石斛与其他居群的铁皮石斛的扩增条带较为一致,而与其他种石斛有较大差异,根据电泳图谱推测,这一样品可以确定为铁皮石斛。 6.云南铁皮石料和浙江富阳野生铁皮石料ITS序列测序的结果表明,云南铁皮石料 的nS序列与Ge娜毗上已有的铁皮石解ITS序列相似度为95o,而富阳野生铁皮石 敬则达到99O/,从分子水平上证明了浙江富阳野生铁皮石料的种质。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S567.2

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【引证文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前1条
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