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《浙江大学》 2005年
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微胶囊固定化细胞色素P450 BM-3的研究

杨建丽  
【摘要】:细胞色素P450BM-3来源于Bacillus megaterium,能催化长链脂肪酸(C_(12)-C_(20))的次末端(ω-1,ω-2,ω-3)羟化及不饱和脂肪酸的环氧化,其突变体催化的底物拓展到中链的脂肪酸(C_8-C_(10))、烷烃、环烷烃、杂环烃、多环芳烃等,因此在医药工业、环境检测和修复及化学工业具有广阔的前景。 论文首先合成P450 BM-3的酶活检测试剂10-对硝基苯氧基癸酸(10-pNCA),其合成是以10-溴代癸酸为原料,与甲醇反应生成10-溴代癸酸甲酯,接着对硝基酚钠反应生成10-对硝基苯氧基癸酸甲酯,最后用固定化脂肪酶水解得到10-pNCA。经紫外光谱、~1H-NMR、~(13)C-NMR和酶分析应用表明成功合成出10-pNCA,总收率达到71.6%。 其次将已构建的质粒转入大肠杆菌DH5α中发酵培养,考察了硫酸铵沉淀前后P450 BM-3酶活的变化,结果表明,经硫酸铵沉淀后,粗酶的酶活、蛋白含量和比活分别是破胞上清液的2.73、1.72和1.61倍,硫酸铵沉淀起了初步分离和浓缩的作用,所制粗酶作为后续固定化的原料。 研究了NaCS-PDMDAAC微胶囊的制备装置和制备方法,考察了不同PDMDAAC分子量、成胶囊时间对形成的微胶囊膜的强度、膜厚、粒径等物理性质的影响,并确定了微胶囊的制备条件:PDMDAAC的分子量为400,000~500,000,成胶囊时间为40~60min。 对NaCS-PDMDAAC生物微胶囊作为P450 BM-3固定化材料的一些必需性质进行研究,结果表明,BSA不能从溶液中扩散进入空白的微胶囊,P450 BM-3催化所需的辅酶NADH、底物10-pNCA均能顺利地扩散至微胶囊内部,NaCS-PDMDAAC生物微胶囊与P450 BM-3酶具有良好的生物相容性。这些表明该胶囊体系比较适合P450 BM-3的固定化。 NaCS-PDMDAAC微胶囊固定化P450 BM-3的最佳条件:pH为8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液、0.5~1mgPro/(mL NaCS)的加酶量、分子量400,000~500,000的PDMDAAC、4.0%的NaCS溶液、胶囊固化40~60min。在此条件下,蛋白包埋率可达85~90%,相对酶活达30~35%,酶活回收率达30%左右。 对固定化P450 BM-3酶学性质的研究表明,固定化酶的最适温度为42℃,比游离酶37℃有所提高,固定化酶的最适pH为7.8,比游离酶pH8.0略有降低,还发现固定化酶对有机溶剂、pH及热稳定性均比游离酶大大提,而贮存稳定性也有了明显的提高,游离酶在4℃下保存酶活下降50%的时间为5~7天,而用NaCS-PDMDAAC微胶囊固定化的酶则长达60~100天。这表明NaCS-PDMDAAC 微胶囊固定化P450 BM一3具有良好的发展前景。 关键词:细胞色素P450 BM一3;固定化;微胶囊;NaCS一PDMDAAC;10一对硝基 苯氧基癸酸 夕
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:TQ460.1

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【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 陆燕;重组P450 BM3工程菌制备靛蓝过程优化、P450 BM3-GDH共表达体系建立及其在靛蓝制备中的应用研究[D];浙江大学;2007年
【参考文献】
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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8 任慧霞;赵雪;聂晓燕;;健脾止遗片有效成分对家兔膀胱明胶酶作用的研究[A];2006第六届中国药学会学术年会论文集[C];2006年
9 曾义勇;陈洪;;超临界二氧化碳中的脂肪酶稳定性及香茅酯的合成[A];2006年中国香料香精学术研讨会论文集[C];2006年
10 姜兴涛;齐茂强;李庆廷;;非水相生物催化技术在香料行业的应用[A];第七届中国香料香精学术研讨会论文集[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
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9 陶晶;多功能菌剂的组合效应研究及其抑菌物质的特性和分离[D];石河子大学;2009年
10 朱丽英;以壳聚糖和纤维素硫酸钠为主要材料的结肠定位释药载体的研究[D];浙江大学;2011年
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1 周艳华;可溶性鸡蛋壳膜蛋白与多肽的制备及其抗氧化活性的研究[D];华中农业大学;2010年
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10 程小丽;同时分离大豆蛋白和油脂的反胶束体系研究[D];河南工业大学;2010年
【同被引文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前1条
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中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 柴燚;中空海藻酸钙微胶囊的性质及其固定化枯草杆菌生产纳豆激酶的研究[D];浙江大学;2004年
【二级引证文献】
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1 辛嘉英;王艳;章俭;宋昊;夏春谷;;生物合成靛蓝的研究进展[J];现代化工;2008年07期
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【相似文献】
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3 薛峰;郑向军;黄晓青;;喷雾干燥微胶囊化中的玻璃体形成理论[A];北京食品学会青年科技论文集[C];1992年
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8 曾海涛;董炎明;周花;曾志群;;壳聚糖衍生物/碳纳米管微胶囊在有机溶剂中的分散性研究[A];2009年全国高分子学术论文报告会论文摘要集(上册)[C];2009年
9 孙爱兰;谭天伟;;香精的微胶囊化及其性能的测定[A];第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2004年
10 田云;卢向阳;何小解;黄成江;罗泽民;;微胶囊化儿茶素的制备[A];中国科学技术协会2004年学术年会海南分会场“中国生态药业与药谷建设”论文集[C];2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
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9 实习生 潘艳华 本报记者 李丽云;小金豆中钻研出朗朗乾坤[N];科技日报;2005年
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9 刘辉;芹菜籽油的提取纯化及降血脂功能研究[D];沈阳农业大学;2009年
10 吴钢;皮下预血管化对共微囊法异种胰岛移植影响的实验研究[D];复旦大学;2007年
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2 张云;薰衣草精油的提取、分离、抗氧化性及微胶囊化研究[D];新疆农业大学;2008年
3 徐文秀;丁香油的提取及微胶囊化技术研究[D];山西农业大学;2005年
4 王燕梅;新型可逆示温材料的微胶囊化研究[D];西北工业大学;2006年
5 张美霞;超临界CO_2萃取及β-环糊精微胶囊化姜油树脂的研究[D];西南农业大学;2003年
6 李川;超临界CO_2萃取及酵母胞壁微胶囊化姜油的研究[D];西南农业大学;2001年
7 陈影;乳脂肪水解及其产物的微胶囊化[D];天津科技大学;2004年
8 安健;天然抗菌成分盐酸小檗碱微胶囊的制备及抗菌性研究[D];苏州大学;2008年
9 张帆;肠溶性双歧杆菌微胶囊制备及其相关特性的研究[D];东北林业大学;2008年
10 陈志辉;胡萝卜素提取纯化及其微胶囊制备工艺研究[D];新疆农业大学;2005年
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