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微胶囊固定化细胞色素P450 BM-3的研究

杨建丽  
【摘要】:细胞色素P450BM-3来源于Bacillus megaterium,能催化长链脂肪酸(C_(12)-C_(20))的次末端(ω-1,ω-2,ω-3)羟化及不饱和脂肪酸的环氧化,其突变体催化的底物拓展到中链的脂肪酸(C_8-C_(10))、烷烃、环烷烃、杂环烃、多环芳烃等,因此在医药工业、环境检测和修复及化学工业具有广阔的前景。 论文首先合成P450 BM-3的酶活检测试剂10-对硝基苯氧基癸酸(10-pNCA),其合成是以10-溴代癸酸为原料,与甲醇反应生成10-溴代癸酸甲酯,接着对硝基酚钠反应生成10-对硝基苯氧基癸酸甲酯,最后用固定化脂肪酶水解得到10-pNCA。经紫外光谱、~1H-NMR、~(13)C-NMR和酶分析应用表明成功合成出10-pNCA,总收率达到71.6%。 其次将已构建的质粒转入大肠杆菌DH5α中发酵培养,考察了硫酸铵沉淀前后P450 BM-3酶活的变化,结果表明,经硫酸铵沉淀后,粗酶的酶活、蛋白含量和比活分别是破胞上清液的2.73、1.72和1.61倍,硫酸铵沉淀起了初步分离和浓缩的作用,所制粗酶作为后续固定化的原料。 研究了NaCS-PDMDAAC微胶囊的制备装置和制备方法,考察了不同PDMDAAC分子量、成胶囊时间对形成的微胶囊膜的强度、膜厚、粒径等物理性质的影响,并确定了微胶囊的制备条件:PDMDAAC的分子量为400,000~500,000,成胶囊时间为40~60min。 对NaCS-PDMDAAC生物微胶囊作为P450 BM-3固定化材料的一些必需性质进行研究,结果表明,BSA不能从溶液中扩散进入空白的微胶囊,P450 BM-3催化所需的辅酶NADH、底物10-pNCA均能顺利地扩散至微胶囊内部,NaCS-PDMDAAC生物微胶囊与P450 BM-3酶具有良好的生物相容性。这些表明该胶囊体系比较适合P450 BM-3的固定化。 NaCS-PDMDAAC微胶囊固定化P450 BM-3的最佳条件:pH为8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液、0.5~1mgPro/(mL NaCS)的加酶量、分子量400,000~500,000的PDMDAAC、4.0%的NaCS溶液、胶囊固化40~60min。在此条件下,蛋白包埋率可达85~90%,相对酶活达30~35%,酶活回收率达30%左右。 对固定化P450 BM-3酶学性质的研究表明,固定化酶的最适温度为42℃,比游离酶37℃有所提高,固定化酶的最适pH为7.8,比游离酶pH8.0略有降低,还发现固定化酶对有机溶剂、pH及热稳定性均比游离酶大大提,而贮存稳定性也有了明显的提高,游离酶在4℃下保存酶活下降50%的时间为5~7天,而用NaCS-PDMDAAC微胶囊固定化的酶则长达60~100天。这表明NaCS-PDMDAAC 微胶囊固定化P450 BM一3具有良好的发展前景。 关键词:细胞色素P450 BM一3;固定化;微胶囊;NaCS一PDMDAAC;10一对硝基 苯氧基癸酸 夕


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