在支气管哮喘发病中磷酸二酯酶4活性和表达的变化及选择性磷酸二酯酶4抑制剂的影响

【摘要】：磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)是一类催化水解cAMP和cGMP,使其转变为失去活性的单核苷酸的关键酶,是cAMP和cGMP水解的唯一途径。PDE的活性是调控细胞内信号转导的强度和持续时间的重要因素。至今已鉴定出PDE有11个家族,共30余种。PDE4是cAMP代谢的主要调节者,是炎症和免疫细胞的主要PDE同工酶,也是分布于肺部的主要PDE同工酶,是PDE家族中最大的一群,有四个亚型(PDE4A、B、C、D)。哮喘是一个常见的呼吸系统疾病,在世界上患病率约13%。然而,目前尚缺乏有效和特异性的药物治疗。已有大量证据的显示PDE4抑制剂对哮喘炎症能发挥强大的抗炎作用,包括在各种细胞模型及许多炎症动物模型。此外,PDE4抑制剂还有一定的支气管平滑肌扩张作用,可能为哮喘的治疗提供全面的作用。已在临床试用于治疗哮喘和COPD,结果令人鼓舞,表明PDE4抑制剂可能是一类非常有前景的药物。 但有关肺组织中PDE4的问题至今尚未研究清楚:(1)哮喘的发病过程中,肺组织中PDE4的活性是否变化?(2)如果肺组织中PDE4的活性有改变,那么其蛋白水平和mRNA水平是否变化?这种变化的上下游调节机制如何?我室已有的研究表明SD大鼠用卵白蛋白致敏2周后,重复抗原攻击后大鼠肺组织匀浆cAMP-PDE和cGMP-PDE活性均较正常对照组明显升高,且cAMP-PDE活性比致敏不攻击组也明显升高。说明在哮喘发病过程中肺组织中的PDE活性已经受到某些因素的影响而升高。那么有关其蛋白水平和mRNA水平是否变化及其调节机制,国内外尚无文献报道。 本文采用卵白蛋白致敏雄性SD大鼠,经抗原反复攻击制备大鼠的哮喘模型,确证致敏后反复抗原攻击是否引起cAMP-PDE活性的升高,从细胞和分子水平分析其活性 浙江大学博士学位论文 匆 升高的机理。同时比较了选择性PDE4抑制剂Piclalnilast和其“me一too’’的新药cidamilast 的治疗作用。主要内容如下: 1、致敏大鼠抗原攻击引起肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞聚集及抗炎药物的影响 对哮喘模型大鼠(。valb切min sensitizatinn and chailengedrats,oVA.s/c)进行支气 管肺泡灌洗,BALF进行白细胞计数,离心后的细胞沉淀涂片,进行分类计数。结果 发现BALF中白细胞计数和嗜酸性粒细胞数目与对照组比较,差异均极显著 少0 .001)。PDE4抑制剂Pidamilast、ciclalnilast、rohpn址n均能明显抑制OvA诱导 的BALF中的总细胞数与嗜酸性粒细胞数目的增加,但piclamilast与cid剐爪ilast组间 无显著性差异。 2、致敏大鼠抗原攻击引起肺组织匀浆PDE活性变化及抗炎药物的影响 用Hl,LC测定肺组织匀浆PDE活性,结果发现哮喘模型大鼠【ovalb切min~itized 助d eh习lenged rats edded/or not atlded heat kined bordetenape血55155 adjuvant,OVA S/c(+/.)B]哮喘模型大鼠肺组织匀浆中cAMp一PDE活性是明显升高,与正常组比较差 异显著,而cG侧[P一PDE活性变化不明显。各用药组均不同程度地影响cAN田一PDE和 cG侧田一pDE活性。以Rolipn址n、pielamilast和eiclaJ叭ilast lmg/kg对cAMp一DE活性 的抑制作用最明显,对cGNIP一DE活性也有明显抑制作用。 3、致敏大鼠抗原攻击引起肺功能的变化及抗炎药物的影响 OVA一S/c忍大鼠的肺顺应性下降而肺阻力增加,与正常对照组相比均有显著性 差异。Rohpn双n能明显改善肺功能,对肺顺应性及肺阻力的影响呈现出明显的剂量依 赖性。 4、致敏大鼠抗原攻击引起肺组织IL-4含量的变化及抗炎药的影响 用ELISA法测定肺组织匀浆IL一4含量,结果发现致敏后重复抗原攻击大鼠肺组织 IL一4含量明显增高。Rohpr印m均能使致敏后重复抗原攻击大鼠肺组织IL一4含量显著 降低。 5、致敏大鼠抗原攻击引起肺组织病理学改变的关系及抗炎药物的影响 OVA一SIC大鼠肺组织有明显的嗜酸性粒细胞浸润、明显组织水肿和上皮脱落损伤 表现及大气道杯状细胞明显增多。piclamilast和ciclamilast剂量依赖性抑制肺部的炎 症表现,以pielamilast 3mg瓜g,eielamilastlomg/kg作用最明显。 6、致敏大鼠抗原攻击引起肺组织匀浆cAMP一PDE活性与有关指标的相关性分析 本课题受国家自然基金(No.39970857)和浙江省自然基金重点项目(No.2204198)资助 浙江大学博士学位论文 匆 肺组织匀浆cAMp一PDE活性与BALF中的嗜酸性粒细胞数目、病理切片中的炎症 细胞总评分及肺组织匀浆IL一含量存在明显的相关性,相关系数分别为0.3 14、0.407 和0.563(P0 .01),而与cGMP一PDE活性之间无相关性。 6、致敏大鼠抗原攻击引起肺组织匀浆PDE活性升高的组成分析 致敏大鼠抗原攻击引起cAMP一PDE活性是明显升高的,其中以PDE4活性增高为主。 PDE4的活性约是正常大鼠的1 .7倍,而正常大鼠的肺组织的PDE3的活性约是哮喘大鼠 的1.6倍。致敏大鼠抗原攻击大鼠的肺组织匀浆中PDE3的活性有升高,可能是哮喘大 鼠肺组织cGMP,PDE活性升高的原因。 7、致敏大鼠抗原攻击引起肺组织中PDE4亚型免疫组化的分布、PDE4亚型蛋白表达 及抗炎药物的影响 在卵白蛋白致敏并攻击的大鼠肺组织中,PDE4的表达明显增强,以支气管上皮细 胞和炎症细胞表达增强较明显。在亚型表达上,PDE4A、4D分布较广泛,在气道平 滑肌、血管平滑肌、气道上皮细胞及炎症细胞均有表达,‘PDE4B主要分布于炎