PPA Rgamma配体对糖尿病大鼠肾动脉内皮超微结构、AT1-receptor mRNA和血浆Angiotensin-Ⅱ影响的研究

【摘要】：众所周知,糖尿病是一种全球性疾病,它的发病率在以惊人的速度增加,它已经成为继心血管疾病和肿瘤之后威胁人类的“第三号杀手”。糖尿病的重要病理改变是血管病变(包括微血管和大血管),糖尿病性血管病变与糖尿病的死亡率直接相关。内皮是血管的重要组成部分,它是一种新陈代谢活跃的组织,它在动脉粥样硬化中扮演重要角色。糖尿病血管病变最主要的表现,主要在于血管内皮功能(包括调节血管张力,维持血液循环压力和流动等)的改变,及血管内皮直接参与炎症反应。 肾动脉内皮结构是观察大血管内皮病变的一个窗口,也是研究血管疾病、肾病以及其它疾病并发症的扳机点。肾动脉的结构和舒缩功能与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)紧密相关,而RAS又是心血管系统结构和功能的重要调节者。血管紧张素Ⅱ(Angiotensin-Ⅱ)是RAS系统的主要元素,它在全身动脉血压的快速调节和慢速调节中起着中心作用,也在心血管疾病的发生发展中有特殊作用,这些作用主要通过AT1(Angiotensin-Ⅱ receptor 1)和AT2介导。 过氧化物酶体增生物激活受体(peroxisome proliferator activated receptorsgamma:PPARgamma)在是新近发现的血管病理改变的靶目标物质,它通过调节基因表达对细胞外刺激作出应答。PPARgamma属于核激素受体超家族的配体(ligand)激活的转录因子,PPARgamma配体是脂肪和血糖代谢稳定的关键调节因子。关于PPAR gamma配体、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)对血管作用的研究日新月异,大量的研究表明PPAR gamma配体、ACEI、ARB均具有抗炎、抗 浙江大学内科学(心血管学)陆颖理博士论文导师胡申江教授 氧化、抗增殖等血管内皮的保护作用。 这些现象让人们思索:是否它们在细胞内外有相似作用,或它们作用之间存在内 在的相互联系? 研究目的 1.明确不同时期、不同性别的糖尿病大鼠肾动脉内皮超微结构改变。 2.明确即ARg~a配体是否对STZ诱导的非2型糖尿病大鼠的血管病变有保护作用。 3.明确糖尿病大鼠肾动脉内皮结构破坏后,外周血浆Angiotensin一11浓度与肾动脉 ATI欣NA表达及它们之间的关系。 4.明确即AR galnlna配体是否影响外周血浆Angiotensin一n浓度和肾动脉ATlmRNA 表达。 实验材料和方法 一建立糖尿病动物模型 1.购置50只10周龄Sprague一Dawley(SD)大鼠,其中雄性为25只,雌性为25只; 平均体重3巧士30.069,平均血糖96士4.86 mg/L《, 2.全部SD大鼠在清洁性(二级)条件下饲养,室内温度为巧一25“C,12小时光亮, 12小时黑暗,食物与饮水能自由得到。 3.糖尿病模型建立后第2天起,其中的10只大鼠(雄性5只,雌性5只)用PPARgalnln 配体代表物:罗格列酮(rosiglitazone R) lmg/k酬day生理盐水溶解后灌胃,糖尿 病大鼠每天测尿糖一次,每周测血糖一次,使糖尿病大鼠模型的血糖在250一500 mg/L之间。 4.大鼠处理:模型建立后6周和10周,大鼠以氯胺酮针35mg/kg和苯巴比妥针 50mg/kg腹腔内注射麻醉,抽取腔静脉血sml,为第二部分实验用,用快速法血 糖测定仪(美国罗氏公司Adantage)测血糖,并把所有的数据详细记录。 浙江大学内科学(,心血管学)陆颖理博士论文导师胡申江教授 5.统计学处理:数据用平均值X士标准差S表示,采用多组方差分析SPSS 10.0 for windows One一Way ANOVA统计。 6.取6周模型正常大鼠雌雄组、糖尿病大鼠雌雄组;10周模型正常大鼠雌雄组和糖 尿病大鼠雌雄组,糖尿病罗格列酮雌雄组的肾动脉分别制作扫描电镜标本。 二.扫描电镜标本制作 1.标本取材:用锋利清洁之手术刀割取肾动脉组织.,长度为10Inln,直径1.Slnln左 右,在中间1/2处切断,一分段作为观察电镜标本,另外一分段作为测定血管紧张 素一H受体mRNA表达用。操作动作轻巧、敏捷,防止对样品挤压损伤,同时对样 品观察面作好标记。 2.清洗:用生理盐水冲洗以洗去标本上的血液,这时始终保持标本湿润,严防发生 空气干燥,以免造成标本皱缩、塌陷或变形。 3.固定:用2.5%戊二醛固定液(pH7.2一7.4)固定标本,时间为3一5小时,4oC,然后 用0.IM PBS漂洗三次,每次巧分钟,洗净组织中戊二醛固定液,再用1%四氧化 饿固定2小时,4oC,再用0.IM PBS漂洗三次,每次巧分钟,洗去组织中四氧化 饿。 4.脱水:用不同浓度的乙醇,采取“梯度脱水洗”逐步取代样品中的水分,脱水乙 醇浓度依次为30%、50%、70%、80%、90%及100%(两次),每级浓度停留15分钟, 再经100%丙酮15分钟,以便置换乙醇,经中间液醋酸异戊酷巧分钟,以置换标 本中的丙酮,便于与临界点干燥液液态C仇互溶。 5.本干燥处理:采用临界点干燥法(临界点干燥器)。 6,光学显微镜用显微外科手术器械(显微镊子,显微剪刀等)把上述处理过的肾动脉 轻柔地剪开,暴露动脉内膜面,如图: 浙江大学内科学O自血管学)陆颖理博士论文导师胡申江教授 7.样品的粘贴与安置:经临界点干燥处理的样品,采用特制导电胶将样品粘贴、安置 在金属样品托上,注意要确实贴牢,保证需观察面(血管内皮)向上,待导电胶干 透再放入离子溅射仪真空室进行镀膜。 8.样品的导电处理:采用金属镀膜法,用EIO20离子溅射仪进行镀金处理; 9.在扫描电子显微镜下观察、拍照(Leica一Stereoscan 260)(