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丝瓜籽蛋白Luffin-a的基因克隆和表达

徐小蓉  
【摘要】:[目的] 丝瓜籽蛋白(luffin)是存在于丝瓜籽中的一组单链核糖体失活蛋白(ribosome inactivating proteins,RIPs),由于它们的抗病毒活性和对蛋白质生物合成的抑制作用,受到广泛关注。目前已经纯化出多种类型的丝瓜籽蛋白,主要有luffin-a、luffin-b、luffin-s、luffincylin、luffin-P1,其中,luffin-a由247个氨基酸组成,对兔网织红细胞裂解液的蛋白质合成有强烈的抑制作用,其IC_(50)为1.4×10~(-11)mol/L,是迄今报道毒性最强的单链核糖体失活蛋白之一。最近,Au等发现Luffin-a能够强烈抑制HIV-1病毒的复制,可能有临床应用前景。本研究旨在利用基因工程方法克隆丝瓜籽蛋白luffin-a的基因,构建其表达载体,并获得有活性蛋白,为基因工程生产和改造luffin-a奠定基础。 [方法] 根据报道的cDNA序列,设计合成两条引物,在两条引物上分别添加Nde Ⅰ酶切位点,TGA终止密码子和BamH Ⅰ酶切位点,用RT-PCR的方法从未成熟的丝瓜籽中克隆luffin-a基因,与pMD18-T Simple Vector连接,连接产物转化感受态大肠杆菌JM109,挑取白色单克隆菌落扩增,少量抽提质粒,Nde Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定。对确实含有外源片段的阳性亚克隆测序,用限制性内切酶Nde Ⅰ和BamH Ⅰ对测序结果满意的亚克隆产物进行双酶切,目的基因片段切胶回收,与经相同酶切的pET44a-c(+)载体连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),涂LB平板,挑取转化成功单克隆菌落扩增,少量抽提质粒,双酶切、小量表达鉴定重组质粒。将含有正 浙江大学硕士学位论文徐小蓉 确表达载体pET-44a(+lufA的转化菌BL21(DE3)IPTG诱导表达,收集菌体沉淀, 将沉淀超声破菌,将超声所得沉淀反复洗涤,尿素溶解包含体,透析复性。复性 蛋白溶液用Blue一SePharose 6B亲和层析纯化,经SDS一队GE电泳检测,用MTT 法检测细胞毒性。用统计学方法比较tuffin一a组和RTA组(对照组)细胞存活率的 差异。 【结果】 Rl;PCR产物经1%琼脂糖电泳,澳乙锭染色后,在紫外光下可见一条明显的 约76ObP的亮带,与预计的目的片段长度大小一致。 目的片段与T载体连接产物转化感受态JM 109,长出白色克隆,抽提质粒 用拟由I和刀。功Hl双酶切确认外源片段插入,经测序证实该片段序列与所报道 的l此阮.a核昔酸序列同源性为99.73%,两者编码的氨基酸序列则完全一致。 重组质粒pET-44岭}lufA用筋由I和刀。从Hl双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳。可 见大小约5 600bP和750bP的两个片段,说明lu乙气的编码基因已插入pET-44a-c(+)。 含重组子pE下44a(+)一lu£气的大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达,菌液及菌体超声 破菌后沉淀和上清12%SDS一PAGE电泳,经诱导菌液泳道及超声沉淀泳道均可 见一分子量约为27切的蛋白条带,与luffin一a的分子量吻合,而未诱导菌液与超 声上清无相应条带,这说明hiffin-a以包含体形式正确表达。包含体反复洗涤后纯 度达70%以上,尿素溶解,透析复性所得产物纯度约30%,复性率较低。复性液 经Blue一sepharose 6B纯化,sDS.PAGE检测,结果显示其纯度大于90%。MTT法 进行毒性检测,表明复性纯化后的luffin.a具有与蓖麻毒素A链(RTA)相似的细 胞毒性。 【结论】 本实验采用RJ’- PCR的方法,从未成熟丝瓜籽中克隆得到了正确的luffin-a基 因,并将其插入到载体质粒pET-44a(+)中,成功构建了luffin一a的表达质粒pET- 44a(+).】uffin-a。重组质粒转化的大肠杆菌BLZI(DE3)在IPTG诱导下,表达出 分子量约为27kD的蛋白质,与目的蛋白分子量一致。而蛋白质电泳表明目的蛋 白主要以包含体形式表达,所得包含体经反复洗涤后纯度可达70%以上。洗涤后 3


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