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棉铃虫核型多角体病毒(HearSNPV)ORF33、ORF80、ORF81和ORF83基因分析

王敦  
【摘要】:昆虫核型多角体病毒(NPV)属杆状病毒科,是无脊椎动物、特别是鳞翅目昆虫的病原性天敌,在害虫种群的自然控制和维持生态平衡方面发挥着重要作用,在世界范围内,NPV已开发为棉花、蔬菜等经济作物的生物杀虫剂。棉铃虫核型多角体病毒HearSNPV的G4和C1株基因组DNA全序列已完成测定,其中一些基因的功能被阐明,但还有许多基因的功能尚不清楚。在HearSNPV C1和其他己报道的杆状病毒的同源基因中,ORF33、ORF80、ORF81、和ORF83这4个基因尚没有研究报道。本研究通过对这4个基因克隆表达和抗体的制备、在感染昆虫细胞中的检测、表达产物定位、基因的转录时相和在宿主细胞内的表达时相,来探讨这4个基因的功能。旨在丰富杆状病毒分子生物学,为杆状病毒的遗传改良,研制更有效的基因工程载体和病毒杀虫剂提供理论基础。以下为取得的主要研究结果: 1.HearSNPV ORF33基因分析结果 HearSNPV ORF33基因位于基因组27566bp~28282bp,基因全长717 nt,编码238 aa,预测编码蛋白分子量为28.4kDa。ORF33起始密码子上游139 nt处有典型的杆状病毒早期基因转录启动子特征序列AACAGT,127nt处有一个TATA框。ORF33的推导氨基酸序列中含有10个磷酸化位点。ORF33在杆状病毒中是一个比较保守的基因,与HzSNPV的同源性为100%,与其它13个NPV的同源性为44-55%,而与7个GV的同源性仅为31~35%。ORF33包含一个类似Nudix酶系的同源序列,其特征序列为GX5EX7REUXEEXGU,并且该Nudix酶系的同源序列在14种NPV和7种GV中都很保守。 Northern blot分析表明,ORF33是一个早期转录基因,在3 h p.i.就可以检测到其转录产物(0.7kb),并持续到48 h p.i.,该转录模式与其核苷酸序列中含有的杆状病毒杆早期基因转录启动子特征序列AACAGT吻合。通过构建ORF33-pGEX-4T2表达载体,在大肠杆菌BL21中融合表达ORF33,表达产物分子量为26 kDa,小于预测蛋白分子量,分析是由于ORF33中包含有数个在大肠杆菌中tRNA丰度非常低的稀有密码子,导致在原核表达系统中表达不完全。但ORF33在大肠杆菌中表达量高,占细菌总蛋白的10.1%。表达产物纯化回收,免疫家兔制备了多克隆抗体。 通过Bac to Bac系统,在Tn细胞中成功表达了ORF33,表达量占细胞总蛋白的5.1%,表达蛋白分子量与预测蛋白分子量接近。利用 ORF33融合表达的EGFP荧光标记,对ORF33


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