茶树主要品质性状关键基因的反义基因遗传转化及表达研究

【摘要】：茶树(Camellia sinensis(L.)O Kuntze)是我国重要的一种经济作物。随着我国现代社会需求的迅猛发展,茶树优良品种的培育与推广也在进一步加快,传统的育种方法因为周期长已经不能满足社会对茶产品的需要;当前分子生物学,尤其转基因技术已趋成熟,因此被广泛运用到包括茶树在内的植物育种工作中。 咖啡因是一种兴奋剂,过量摄入可以便人产生心悸、胃肠失调、焦虑、震颤、血压升高和失眠等等症状。随着人民生活条件的好转,对健康的关注,低咖啡因茶产品开发就受到了瞩目。由于传统手段的种种不足,我们使用基因工程技术,通过调控咖啡因合成途径中的关键酶来培育新的育种材料。 经研究发现:S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶和茶树咖啡因合成酶(TCS)基因是茶树中的咖啡因生物合成途径中关键的基因,对咖啡因的生物合成有重要作用。本论文使用RT-PCR扩增SAM合成基因片断,并对其进行酶切、连接,把它连接到质粒pCAMBIA1301上,构建了pCAMBIA1301-antiSAMS重组质粒,然后使用三亲交配法,将这个重组质粒导入到发根农杆菌LBA9402中,并对茶树通过发根农杆菌转化,适宜的转化条件为:采用了YMB培养基共培养;不添加PVP进行预培养;选择60d-70d的苗龄的茎段外植体,从而得到了大量的发状根,经GUS化学检测证明pCAMBIA1301-antiSAMS重组质粒已经转入到发状根里。 用不同剂量和不同时间的紫外处理SAM和TCS合成酶基因,结果发现紫外胁迫对影响咖啡因合成的主要生化酶SAM和TCS基因基本没有响应,只有在高剂量长时间(191.2μw/cm~2,720min)条件下发生不可逆转的伤害才会影响两种酶基因的表达。 茶儿茶素是茶多酚中最重要的物质。主要有EGCG等8种,这些化合物是茶叶主要的品质成分和功能性成分。它可以抗氧化、抑制肿瘤、保护心血管系统和抗微生物等作用。因此,培育高儿茶素茶品系也是目标育种的一个方向。茶叶中儿茶素含量和组成的差异主要受到品种和栽培环境条件的影响,而环境因素中以太阳辐射对茶叶儿茶素含量和组成影响最大。本文就紫外不同辐射剂量和辐射时间对茶树叶片儿茶素的变化进行了研究,发现低剂量的UV-B条件下,茶