RAPD研究紫外诱变后的链霉菌AP19-1基因组DNA突变

李欧

【摘要】：随机扩增多态性DNA(RAPD)利用一系列随机排列的寡核苷酸单链引物,以研究对象的基因组DNA为模板进行PCR扩增,通过扩增产物DNA片段的多态性来检测基因组DNA的多态性。然而,由于RAPD分析重复性较差和存在假带现象,如果没有一个统一的优化条件,将导致试验结果的失真。通过对Mg~(2+)、dNTP、模板浓度、引物浓度、‘Taq酶浓度等反应体系进行浓度梯度研究及对退火温度、退火至延伸时的ramp速度、循环次数等反应条件进行优化。找出本实验室条件下的链霉菌 APl9-1的最佳RAPD扩增条件:扩增反应的总体积为20gl,其中包括1×buffer, 3.OmM MgCl_2 400μM dNTP,0.4m引物,2.5UT aq酶及200ng模板DNA,扩增程序为94℃预变性5分钟,94℃变性30秒,36.4℃退火30秒,72℃延伸2分钟,共40 个循环,最后在70℃延伸10分钟。其中从退火到延伸的ramp时间为108秒。在获得的最佳扩增条件的基础上,利用50种RAPD随机引物对野生型菌株及紫外诱变后得到的高产菌株进行RAPD比较分析。发现引物BAO22能检测出高产菌株与野生株差异,即高产株出现了两条特异性的条带,其大小分别为480bp和570bp左右。回收特异性条带,经T—A克隆后测序,用BLAST程序在NCBI上进行比对,发现480bp 左右的条带与一种产志贺毒素(shiga toxin)的大肠杆菌的毒力岛基因簇中的一段基因间序列有100%的相似性。推测此序列可能与APl9—1的抗生素相关基因的调控有关。

【关键词】：链霉菌 RAPD 条件优化 紫外诱变 序列比对
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：Q933
【目录】：

摘要5-6
Abstract6-7
前言7-11
材料与方法11-21
1．菌株11
2．培养基和试剂11-13
3．主要仪器设备13-14
4．菌株AP19-1诱变育种14-15
4．1 链霉菌孢子悬液的制备14
4．2 孢子的紫外诱变14
4．3 菌种的发酵14
4．4 抗生素效价测定14-15
4．5 诱变菌株的筛选15
5．RAPD扩增条件的优化15-16
5．1 链霉菌基因组DNA的提取15
5．2 RAPD引物的筛选检测15
5．3 RAPD条件的优化15-16
6．野生型、高产菌株的比较分析16
7．特异性片断的割胶回收16-17
8．T-A克隆17
9．感受态的制备及转化17-18
9．1 感受态的制备17-18
9．2 转化18
10．转化产物的鉴定18-20
10．1 菌落PCR检测19
10．2 双酶切检测19-20
11．测序20-21
结果21-35
1．链霉菌AP19-1 RAPD条件的优化21-29
1．1 不同的模板DNA浓度对RAPD扩增的影响21-22
1．2 不同的Mg~(2+)浓度对RAPD条带的影响22-23
1．3 不同的dNTP浓度对RAPD扩增的影响23-24
1．4 不同的引物浓度对RAPD扩增的影响24-25
1．5 不同的Taq酶浓度对RAPD扩增的影响25-26
1．6 不同的退火温度对RAPD扩增的影响26-27
1．7 不同的ramp时间对RAPD扩增的影响27-28
1．8 不同的循环数对RAPD扩增的影响28-29
2．野生型及诱变后的高产菌株的RAPD条带的比较分析及差异性条带的回收了T—A克隆29-30
2．1 野生型对照、高产菌株的RAPD比较验证基因组的改变29
2．2 菌落PCR及双酶切验证T-A克隆的结果29-30
3．RAPD差异性条带的测序及序列的比对分析30-31
3．1 序列130-31
3．2 序列231
4．其它序列比对分析辅助种的确定31-35
4．1 序列331-33
4．2 其它经比对暂时无同源序列的序列33-35
讨论35-40
1．RAPD的优化35-37
1．1 反应体系的优化35-36
1．2 RAPD-PCR扩增程序的优化36-37
2．RAPD法来检测高产菌株的突变37-38
3．特异性序列比对结果初步分析38-39
4．其它序列比对结果的初步分析39-40
结束语40-41
综述41-52
参考文献(Reference)52-59
致谢59

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