罗氏沼虾诺达病毒单克隆抗体的制备及应用

【摘要】：罗氏沼虾肌肉白浊病(Whitish muscle diseases of Macrobrachium rosenbergii) 是近年来发生于罗氏沼虾苗种阶段的一种疾病,最早于九十年代发现于我国广 东、广西一带,2000年在我国罗氏沼虾主要养殖省市出现暴发流行。病虾出现 肌肉白浊、白斑或白尾症状,又称为白体病、白尾病等,可在数天内发生大量死 亡,死亡率可高达60%以上,严重时可达100%,成为罗氏沼虾养殖的主要威胁。 罗氏沼虾肌肉白浊病的病原是罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirus,MrNV)。罗氏沼虾诺达病毒粒子呈廿面体,无囊膜,大小为23～25nm, 病毒核酸为单链RNA,由2个片段组成,RNA-l和RNA-2,分别为3.0kh和1.3kh。 MrNV为首个从甲壳类中分离到的诺达病毒。 用提纯的MrNV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融 合,得到12株能特异分泌抗MrNV的单克隆抗体(monoclonal antibody,Mab)的 杂交瘤细胞。注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1:10~5～10~6。亚型 鉴定结果表明,有6株单抗为IgGl型,4株单抗为IgG2a型,2株单抗为IgG2b 型。12株单抗与对虾白斑综合症病毒(WSSV)和对虾桃拉综合症病毒(TSV) 均无交叉反应。Western bolt分析表明,小鼠单抗2B5能与MrNV 43kD的外膜蛋 白特异性结合。 制备MrNV兔抗血清,挑选效价高的腹水单抗2B5,建立了检测罗氏沼虾诺 达病毒的三抗体夹心酶联免疫吸附测定法(three antibodies sandwich-ELISA TAS-ELISA),TAS-ELISA最适反应条件为:兔抗体以 lμg/mL包板,小鼠单抗 2B5的工作浓度为1:50,000,该法检测MrNV的灵敏度达0.98ng。通过对病虾 及疑似病虾的病毒检测,表明TAS-ELISA法比间接ELISA法、核酸电泳法有更 高的阳性检出率和符合率;此外还摸索了降低病毒测定孵育温度和缩短孵育时间 对病毒检测的影响,表明各步孵育温度和时间分别为25℃和20min对于白浊症 状的病苗检测无明显影响,使得本法更加适合于生产实践。