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脂肪酶构象刻录及催化能力考察

龚伟  
【摘要】:本文首次阐述了一种新型固定化酶——“刻录酶”的制备方法。和普通固定化酶相比,首先,它在制备过程中加入了配体诱导酶构象;其次,最终制备得到的刻录酶构象是刚性化的。文中对刻录酶的整个制备流程进行了摸索,重点讨论了它在水相和有机相中的催化活性、稳定性以及在有机相中的吸附配体能力,最后利用SEM对刻录酶载体进行了宏观表征。 以聚乙二醇200(400)二(甲基)丙烯酸酯4种不同的功能单体和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为聚合原料,脂肪酶为模板分子,加入配体月桂酸对脂肪酶进行活性构象诱导,再通过紫外光引发聚合以及无水有机溶剂索式抽提月桂酸后,获得了4种锁定脂肪酶活性构象的聚合物,即刻录脂肪酶聚合物。在以无水丙酮为洗脱剂时获得了最高86.31%的月桂酸洗脱率,且脂肪酶的洗脱量保持在一个较小范围。当单体和交联剂以质量比为2:1,紫外光照聚合时间为45s时,所得四种刻录酶都表现出了优异的抗溶胀稳定性,尤其在正庚烷和水中为最佳。这些都基本符合对“刻录酶”载体性能的预期设想。 论文对刻录酶在水相和有机相的催化特性进行了探索。水相催化采用橄榄油水解法,发现四种刻录酶都具有较好的活性和稳定性。它们在水相中最佳催化时间为15min,活性最大在Da(聚乙二醇400二丙烯酸酯为单体的刻录酶)上获得(6.07U/g),活性收率高达171%;同时经过比较,发现含有甲基的单体聚合时容易形成超支化聚合物,增大反应时的传质阻力,造成其活性和活性收率都大大降低:四种刻录酶在强酸(pH=2.42)、强碱(pH=12.00)和高温(80℃)下均可以分别保持它们初始活性的75%、50%和70%以上,其中Da在160℃左右完全失活,这是因为载体在153℃开始热不稳定造成的;用沉淀变性剂和溶解变性剂分别浸泡刻录酶30d后,四种刻录酶仍然可以表现出它们初始活性的50%和45%以上。这说明脂肪酶构象的高度刚性化对它在水相催化时的活性和稳定性都是非常有利的。有机相催化选用月桂酸和正丁醇的正庚烷酯化反应体系,以活性最大的Da为考察对象,发现它在有机相催化中活性较为低下。40℃时催化24h活性为15.30U/g,升温至50℃可以小幅度提升Da活性为16.67U/g,而此时活性仅为固体酶粉的46.88%;但刻录酶优异的稳定性在有机相中继续得以体现。经过5


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