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高品位壳聚糖介导基因载体制备的研究

方文建  
【摘要】:采用实验室筛选菌种Penicillium SP. ZD-Z1进行发酵65-70h以后,发酵液经过抽滤,截留分子量2kDa、10kDa的超滤膜超滤,95%冰乙醇按体积比3:1进行沉淀和5℃、6000r/min下冷冻离心浓缩等步骤,最后经过HiTrap SP阳离子交换柱分离得到两种壳聚糖酶ChA、ChB。讨论了两种酶降解壳聚糖的特性,通过粘度变化和纸层析结果表明,ChA为内切酶,ChB为外切酶,ChA、ChB的米氏常数分别为5. 64g/L和2. 47g/L。两种酶在温度4℃、溶剂为pH4. 4的HAc-NaAc缓冲液中具有很好的稳定性。 利用ChA来制备低分子量壳聚糖,并用MHS方程η=1.02×10~(-4)M_w~(1.27)控制反应过程中壳聚糖的分子量变化。得到内切酶法制备壳低聚糖的最适条件为:30℃、pH5,4%壳聚糖溶液中加入酶活力0.01U/mL的ChA。反应120min后,即可得到分子量5万的目标壳聚糖。 以DEAE纤维素为载体,戊二醛为交联剂,固定化内切酶ChA,并对壳聚糖酶的固定化条件、固定化酶的性质进行了研究。确定了固定化的最佳条件为0. 1gDEAE纤维素与5mL5%戊二醛交联后,加入0. 3mg、活力单位为32. 8U/mg的内切酶进行固定化,最佳交联时间为6h。该固定化酶的最适温度为65℃,最适pH为4. 0。固定化酶具有良好的操作稳定性,将该固定化酶重复使用十次,酶活力损失小于10%,且该固定化酶具有较强的稳定性。在固定化酶反应器(Φ14. 5cm×8. 5cm)中测定了不同流速下固定化酶对1%壳聚糖溶液的降解情况,结果表明,大分子量壳聚糖在流速为5mL/min时,能够降解得特定分子量的壳聚糖产品。 考察了四种阴离子树脂ZGA451、ZGA455、ZGA351、ZGA454对去除乳酸根效果,发现了树脂ZGA454脱盐效果最好。在流速为5ml/min、25℃条件下,经过离子交换后溶液电导率下降了87. 7%,pH值从5. 2上升到了7. 2。喷雾干燥法制备得到固态壳聚糖,喷雾条件为进料速率为15%、入口温度155℃或160℃,喷雾气流大小为50cm。用HPLC法测得喷雾干燥产品S_1、S_2的分子量分别为50377、1062;采用线性滴定法测定了喷雾干燥产品的脱乙酰度,结果表明,由内切酶直接降解制备的低聚糖产品脱乙酰度为84. 85%,而从内切酶和外切酶同时降解的发酵液中分离得到的产品脱乙酰度为76. 82%。


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