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《浙江大学》 2005年
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2-氯丙酸脱卤酶的分离纯化

项炯华  
【摘要】:2-氯丙酸(2-CPA)是合成农药、染料、农林和医药化学品等的重要原料,但是,由于2-氯丙酸具有光学活性,一般只有用(S)-构型2-氯丙酸合成的农药、医药等才具有很高的生理活性或药理作用,用(R)-构型合成的农药活性很低或无活性,且可能以竞争性抑制剂的形式起作用。而(R)-构型的2-氯丙酸在其它某些手性医药及其中间体的合成方面有很重要的应用,如可用于合成抗结核病药物硫乳霉素(thiolactomycin)。 2-氯丙酸脱卤酶有3种,分别为(S)-2-卤酸脱卤酶(EC3.8.1.2)、(R)-2-卤酸脱卤酶(EC3.8.1.9)、(R,S)-2-卤酸脱卤酶(EC3.8.1.10及EC3.8.1.11)。利用脱卤酶可选择性地高效拆分2-氯丙酸。 本文的研究目的是筛选对2-氯丙酸具有脱氯能力的菌株,并建立脱卤酶的分离纯化方法,从而为利用脱卤酶生产(S)-及(R)-构型光学活性2-氯丙酸奠定基础。 本文首先从杭州、温州、富阳等农药厂附近所采集的11个土样出发,筛选出了21支对2-氯丙酸具有脱卤活性的菌株。其中H9脱卤能力较强,S4和W20脱卤酶分别对(S)-2-CPA和(R)-2-CPA具有一定的选择性脱卤能力。 由于(R)构型脱卤酶的应用更为广泛,因此本文重点针对W20脱卤酶进行了分离纯化研究,经过盐析、脱盐、离子交换层析、凝胶层析后获得了电泳纯的脱卤酶,SDS-PAGE测定酶的分子量为35KDa。对部分酶学性质作了考察后发现,W20酶的最适反应pH值为10,最适反应温度为40℃。 最后对W20培养条件进行了考察。最佳培养基的碳源和氮源组合为葡萄糖和尿素。当碳源葡萄糖浓度为20g/L,氮源尿素浓度为1.0g/L时,可以获得较多的菌体和脱卤酶。对菌体的培养温度及培养pH进行考察,发现30℃是菌体生长较适宜的温度,pH7.0是菌体较适宜的培养pH值。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:TQ225

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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【二级参考文献】
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