收藏本站
《浙江大学》 2006年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的克隆表达及生物合成5-氨基乙酰丙酸的研究

刘晓侠  
【摘要】:5-氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid,ALA),是四吡咯类化合物(例如:亚铁血红素、卟啉、叶绿素和维生素B_(12))的共同前体,也是调节四吡咯类物质生物合成的关键代谢中间物,广泛存在于微生物、植物和动物细胞中。近年来,发现ALA在农业上可用作杀虫剂、除草剂及生长调节因子;在医学领域,ALA作为第二代光动力药物,可用于治疗各种癌症,例如:皮肤癌、口腔癌、十二指肠癌、胰腺癌和膀胱癌等。因此对ALA的工业化生产引起了学术界和产业界的重视。 本文从微生物中克隆得到了ALA合成酶基因,构建了高产5-氨基乙酰丙酸的工程菌,通过对工程菌培养条件的优化,大幅度提高了ALA的产量。 研究工作的主要创新点和进展包括: 1) 分别从放射形土壤杆菌(Agrobacterium bacterium zju-0121)和类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)细胞中克隆得到了5-氨基乙酰丙酸合成酶(5-aminolevulinic acid synthase,ALAS)hemA基因,通过对基因的序列分析,发现来自放射形土壤杆菌的hemA基因属于一个新的基因,而来自类球红细菌的hemA基因第335位的氨基酸发生了突变。 2) 分别构建了含放射形土壤杆菌和类球红细菌hemA基因的多个表达质粒并转化到大肠杆菌中。通过对胞外5-氨基乙酰丙酸产量和5-氨基乙酰丙酸合成酶的比活力进行比较,发现用来源于放射形土壤杆菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因所构建的重组菌E.coli BL21(DE3)(pET28-A.R-hemA)具有最高的ALA产量和ALAS活力。 3) 研究了重组菌E coli BL21(DE3)(pET28-A.R-hemA)的摇瓶发酵条件。考察了初始葡萄糖浓度、溶氧、温度、前体及抑制剂对重组菌发酵生产5-氨基乙酰丙酸的影响,确定了最佳的诱导条件和培养条件。在最适发酵条件下,重组菌E.coliBL21(DE3)(pET28-A.R-hemA)摇瓶发酵的5-氨基乙酰丙酸的产量可达1.3g/L,比优化前(没加前体)提高了16.2倍。 4) 利用5L的发酵罐进行工程菌培养生产5-氨基乙酰丙酸的研究,对影响产物产量的因素,如:初始葡萄糖浓度、溶氧、pH值、培养方式进行了考察,在优化条件下,发酵罐中的5-氨基乙酰丙酸的产量可达到3.1g/L,比摇瓶发酵提高了238.5%。以5L发酵罐分批发酵的实验数据为依据,对5-氨基乙酰丙酸发酵动力学进行了研究,分别建立了菌体生长、底物消耗和产物生产的非结构模型。该模型能较好的反映5-氨基乙酰丙酸的分批发酵过程。 5) 针对目标产物ALA非蛋白质,外源基因所表达的产物ALA合成酶只是催化ALA合成的催化剂的特点,提出了基因工程菌培养时必需提高产量酶的催化活性而不是翻译得到的更多蛋白质的观点,并采用了较弱的诱导剂乳糖代替价格昂贵而且有毒的强诱导剂异丙基-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)的新方法进行ALA合成酶的诱导表达。在发酵罐分批培养中,胞外5-氨基乙酰丙酸的产量和ALA合成酶的比活力分别提高了43%和15%。 6) 为了有利于ALA的分离和降低生产成本,采用了以D-葡萄糖代替乙酰丙酸作为ALA脱水酶的抑制剂的方法,通过合适的流加策略使胞外ALA的产量提高到了3.1g/L。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:TQ920.1

手机知网App
【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 程菊娥;5-氨基乙酰丙酸高效表达体系的建立及其应用[D];湖南农业大学;2007年
2 刘锦妮;枯草芽孢杆菌谷氨酰t-RNA还原酶基因(hemA)和谷氨酰t-RNA合成酶基因(hemL)表达载体的构建及优化[D];西北农林科技大学;2008年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 杨如燕,李民,陈常庆;重组大肠杆菌YK537/pSB┐TK高密度培养过程中有机酸的RP┐HPLC快速分析[J];工业微生物;1998年03期
2 张涛铸,谢幸殊,张嗣良,叶勤;γ干扰素工程菌发酵工艺研究[J];华东化工学院学报;1993年02期
3 戚以政;影响固态发酵速率的因素及其动力学[J];化学反应工程与工艺;1995年01期
4 刘秀艳,徐向阳,陈蔚青;光合细菌产生5-氨基乙酰丙酸(ALA)的研究[J];浙江大学学报(理学版);2002年03期
5 赵春晖,穆江华,林建平,岑沛霖;异养培养光合细菌产5-氨基乙酰丙酸发酵条件的研究[J];精细化工;2003年11期
6 张一宾 ,周燚;5-氨基乙酰丙酸的植物生理活性[J];世界农药;2000年03期
7 崛田康司 ,蒋卫平;5—氨基乙酰丙酸对两种草坪生长的影响[J];青海草业;2001年04期
8 李民,陈常庆;重组大肠杆菌高密度发酵研究进展[J];生物工程进展;2000年02期
9 刘秀艳,叶敏,徐向阳;产生5-氨基乙酰丙酸(ALA)光合细菌生物学研究进展[J];生物工程进展;2000年05期
10 乔建军,杜连祥;一种快速有效的枯草芽孢杆菌染色体的提取方法[J];生物技术;2001年02期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 盛清凯,姚惠源,毕建秀;猪生长激素的研究进展[J];山东农业科学;2003年03期
2 郭晓青;李超汉;李青竹;李霞;李衍素;于贤昌;;叶面喷施5-氨基乙酰丙酸对遮阴条件下番茄生长、光合特性和产量的影响[J];山东农业科学;2011年09期
3 罗磊;施碧红;沈加彬;商伟伟;;代谢工程在异亮氨酸生产中的应用研究进展[J];安徽农学通报(上半月刊);2011年23期
4 蒋长苗;吕李明;丁建华;吴代圣;潘国家;;畜禽液态复合益生菌肠泰素的研制与应用[J];安徽农业科学;2009年03期
5 余秉琦;蔡志强;王利群;杨林松;朱劼;朱孝霖;李亮;;异柠檬酸裂解酶抑制剂对L-谷氨酸合成的影响[J];安徽农业科学;2009年23期
6 李美善;刘宪虎;许明子;邱献锟;赵孝东;李玉花;刘桂英;;5-氨基乙酰丙酸处理对水稻籽粒增重的影响[J];安徽农业科学;2010年33期
7 刘焕民;葛向阳;张伟国;;L-缬氨酸产生菌JVHK597的选育及无机盐对其产酸量的影响[J];安徽农业科学;2011年23期
8 李斌;唐英;荣酬;张晓刚;;复合型生物农药的研究进展[J];安徽农业科学;2011年32期
9 王健,陈宁,谭青乔,张克旭;L-色氨酸生产菌的选育及其发酵条件的研究[J];氨基酸和生物资源;2003年03期
10 刘建军,赵祥颖,田延军,李丕武,张家祥,刘丽萍,韩延磊,马春玲;L-亮氨酸的应用及其生产菌的育种思路[J];氨基酸和生物资源;2004年04期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 杨蕊;邹志荣;;ALA肥料对盐胁迫下黄瓜生长发育的促进作用[A];2008园艺学进展(第八辑)——中国园艺学会第八届青年学术讨论会暨现代园艺论坛论文集[C];2008年
2 白新祥;戴思兰;;菊花花色研究进展[A];中国菊花研究论文集(2002—2006)[C];2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 孟凡涛;酒明串珠菌不对称合成手性醇及其反Prelog脱氢酶的酶学特性研究[D];江南大学;2010年
2 田玉庭;辅酶Q_(10)高产菌株选育及发酵过程优化研究[D];西北农林科技大学;2010年
3 张增胜;农村分散式污水处理适用技术及机理研究[D];东华大学;2010年
4 姜珊;两种水产动物抗菌肽的重组表达工艺优化与药理药效研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2011年
5 赵海峰;透明颤菌血红蛋白结构和功能研究[D];吉林大学;2011年
6 陈禹保;四倍体鲫鲤BAC文库构建及其演化分析[D];湖南师范大学;2011年
7 康振;大肠杆菌系统改造及琥珀酸和5-氨基乙酰丙酸合成途径的构建[D];山东大学;2011年
8 宋建民;乳酸片球菌素的表达纯化与高密度发酵研究[D];华东理工大学;2011年
9 李蓓;蒙古马毛色性状相关基因多态性分析及组织表达研究[D];内蒙古农业大学;2011年
10 成飞雪;光合细菌代谢产物5-氨基乙酰丙酸杀线虫作用及其机理研究[D];湖南农业大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈凤鸿;PCR法评价泼尼松龙诱导弓形虫隐性感染小鼠的复发及阿奇霉素对复发的疗效[D];南京医科大学;2010年
2 崔艳玲;基因重组大肠杆菌以不同碳源合成L-苯丙氨酸的比较[D];郑州大学;2010年
3 张志进;论基因专利的规制[D];华东政法大学;2010年
4 陈超;重组大肠杆菌高密度发酵过程建模与控制[D];大连理工大学;2010年
5 张宽亮;含有红色荧光报告基因玉米CobA的T载体和表达载体构建研究[D];安徽农业大学;2010年
6 赵鑫;特异性启动子调控ACC氧化酶反义基因载体构建及对甜瓜‘玉金香’的转化[D];甘肃农业大学;2010年
7 王扬;亚硝基胍诱变选育L-苏氨酸生产菌及其两个关键酶活性的测定[D];甘肃农业大学;2010年
8 李伟星;dapA基因缺失菌株的构建及其发酵条件研究[D];甘肃农业大学;2010年
9 宋振忠;牛结核病三价DNA疫苗制备工艺研究及免疫效果初步评价[D];新疆农业大学;2010年
10 曹剑磊;产琥珀酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能研究[D];江南大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 范镇基;神奇的新除草杀虫剂——δ-氨基乙酰丙酸[J];氨基酸和生物资源;2000年01期
2 范晶,赵惠勋,李敏;比叶重及其与光合能力的关系[J];东北林业大学学报;2003年05期
3 汪良驹,刘卫琴,孙国荣,王建波,姜卫兵,刘晖,李志强,庄猛;ALA对萝卜不同叶位叶片光合作用与叶绿素荧光特性的影响[J];西北植物学报;2005年03期
4 汪良驹,王中华,李志强,刘晖,刘卫琴,陈宗元,颜璞,孙敦乾;5-氨基乙酰丙酸促进苹果果实着色的效应[J];果树学报;2004年06期
5 谢秀祯;黄循吟;韩向红;;提高类球红细菌5-氨基乙酰丙酸产率的措施[J];工业微生物;2005年04期
6 戴秀莲,程虎,陈绯;乙酸乙酯提取比色法测定尿中δ-氨基乙酰丙酸(δ-ALA)[J];工业卫生与职业病;1989年06期
7 宋士清,郭世荣;5-氨基乙酰丙酸的生理作用及其在农业生产中的应用(综述)[J];河北科技师范学院学报;2004年02期
8 刘如林;光合细菌在有机废水处理中的应用[J];环境科学;1991年02期
9 徐向阳;孙琦;;光合细菌在有机废水处理中的应用现状与前景[J];环境污染与防治;1990年05期
10 刘勇,张德咏,王小平;光合细菌PSB-1对辣椒病毒病的防治作用[J];湖南农业科学;2000年06期
中国硕士学位论文全文数据库 前5条
1 赵春晖;光合细菌和重组大肠杆菌生物合成5-氨基乙酰丙酸的研究[D];浙江大学;2004年
2 刘卫琴;5-氨基乙酰丙酸对草莓和萝卜叶片光合作用及叶绿素荧光特性的影响[D];南京农业大学;2005年
3 刘晖;5-氨基乙酰丙酸(ALA)的化学合成及其提高草莓和西瓜耐盐性效应的研究[D];南京农业大学;2005年
4 范理;5-氨基乙酰丙酸的检测方法及其稳定性研究[D];浙江大学;2006年
5 秦钢;重组大肠杆菌生产ALA的培养优化研究[D];浙江大学;2006年
【二级引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 段春燕;枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体的构建及木聚糖酶基因(xynA)的表达[D];西北农林科技大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 徐皓,李民,阮长庚,陈常庆;高密度发酵生产突变型重组人肿瘤坏死因子rhTNFα-DK2的研究[J];工业微生物;1998年02期
2 杨如燕,李民,陈常庆;重组大肠杆菌YK537/pSB┐TK高密度培养过程中有机酸的RP┐HPLC快速分析[J];工业微生物;1998年03期
3 杨如燕,李民,陈常庆;基因工程菌高密度发酵液中碳源物质甘油的定量检测及其浓度的优化控制[J];工业微生物;1999年01期
4 张涛铸,谢幸殊,张嗣良,叶勤;γ干扰素工程菌发酵工艺研究[J];华东化工学院学报;1993年02期
5 戚以政;刘广立;林红缨;莫锡荣;;甘蔗固体发酵制乙醇的动力学[J];化学反应工程与工艺;1992年04期
6 刘秀艳,徐向阳,陈蔚青;光合细菌产生5-氨基乙酰丙酸(ALA)的研究[J];浙江大学学报(理学版);2002年03期
7 高长寿,毛申兰,俞璎,陈常庆;一种新型人肿瘤坏死因子突变体在大肠杆菌中的高效表达[J];生物化学与生物物理学报;1996年01期
8 李民,陈常庆,朴勤,陈苏民;利用恒溶氧-补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组人骨形成蛋白-2A[J];生物工程学报;1998年03期
9 丁明玉,陈培榕,罗国安;食品中有机酸的高效液相色谱分析法[J];色谱;1997年03期
10 宋礼华,桂向东,范清林,魏跃武,姚红谊,王荣海,傅永标,杨少民,康勇;分泌型重组人生长激素的研制[J];生物学杂志;1999年01期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陈罗胜;殷润婷;徐寒梅;奚涛;;重组人内皮抑素工程菌发酵条件的优化[J];药物生物技术;2008年06期
2 汪钊;赵冉冉;应向贤;郭跃平;;酶法制备羟甲基戊二酰CoA还原酶抑制剂手性中间体的研究进展[J];生物加工过程;2010年01期
3 田强;张彩;吴子健;;几丁质酶生产菌的诱变育种及摇瓶发酵条件优化[J];食品科学;2007年09期
4 黄惠莉;欧阳明安;刘金金;;海洋烟曲霉菌产脱乙酰酶发酵条件优化[J];化学研究与应用;2008年03期
5 单咸旸;袁建锋;蒋导航;石楠;武振军;吴启赐;万红贵;;一株芽孢杆菌Bacillus sp.胞外多糖发酵条件优化[J];食品科技;2010年09期
6 孙晓菲;李鑫玲;陈晨;王文胜;刘进;;纤维素酶产生菌的分离及其发酵条件的优化[J];食品研究与开发;2011年08期
7 陈騊声;;生物工程与化学科学[J];化学通报;1984年06期
8 李金华;;“基因”在农业上的重大作用[J];化工之友;2000年02期
9 王俊琦;;gene基因与食品[J];家庭与科学;2001年02期
10 宿红艳;王磊;张萍;冯培勇;崔德才;;控制悬铃木果毛污染的研究进展及其展望[J];江苏农业科学;2005年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 丁卯章;;动物福利理论问题研究[A];林业、森林与野生动植物资源保护法制建设研究——2004年中国环境资源法学研讨会(年会)论文集(第二册)[C];2004年
2 褚志义;;基因工程与医药创新(摘要)[A];上海市老科学技术工作者协会一、二、三届学术年会论文选集[C];2006年
3 励建安;;基因工程与康复医学[A];中国康复医学会全国运动疗法学术会议暨心脑血管病康复研讨班论文汇编[C];2000年
4 苏玉安;左鉴均;;股骨头坏死修复与重建基因工程-三活疗法探讨[A];中国骨伤发展战略高层论坛暨中西医结合骨伤学术大会论文集[C];2004年
5 张上隆;;植物类胡萝卜素的生物合成及其调控[A];张上隆果树学文选[C];2006年
6 张上隆;;类胡萝卜素合成的相关基因及其基因工程[A];张上隆果树学文选[C];2006年
7 李明魁;郭菊;张遂平;;抗菌肽的研究与应用[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
8 李明魁;郭菊;张遂平;;抗菌肽的研究与应用[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
9 贾超;程序;赵串;冯雷;肖建敏;杨科武;;万古霉素耐药基因产物VanX竞争型抑制剂的设计与合成[A];中国化学会第27届学术年会第06分会场摘要集[C];2010年
10 刘敏;章晓联;叶新山;;五种糖苷转移酶抑制剂衍生物的筛选及其对TH1、TH2的选择性抑制[A];湖北省暨武汉市免疫学会第八届学术会议论文集[C];2003年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 黄东临;DPP—4抑制剂浮出水面[N];医药经济报;2007年
2 国文;肿瘤坏死因子抑制剂导致真菌感染[N];中国医药报;2008年
3 静雨;COX_2抑制剂能有效预防癌瘤[N];中国医药报;2002年
4 金永红;医院缺乏知识产权保护意识[N];健康报;2006年
5 金利;基因工程国家一类新药haFGF获证书[N];科技日报;2007年
6 余志平;靶向蛋白酶:成功、失败与前景(二)[N];中国医药报;2006年
7 记者 杨维忠 通讯员 吴延华;东阿阿胶推出溶栓基因工程药[N];中国知识产权报;2007年
8 ;强直性脊柱炎研究亮点:生物治疗[N];健康报;2007年
9 海文;美探索基因工程治孤独症方法[N];中国医药报;2008年
10 本报记者 李远方;通威基因工程打造现代渔业样板[N];中国商报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘晓侠;5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的克隆表达及生物合成5-氨基乙酰丙酸的研究[D];浙江大学;2006年
2 张巍;calpain及calpastatin在小鼠皮肤切创愈合过程中作用的研究[D];中国医科大学;2009年
3 魏华;氧化应激诱导间充质干细胞凋亡及磷脂类分子调节血管内皮生长因子分泌研究[D];中国协和医科大学;2010年
4 黄大卫;组蛋白去乙酰化酶抑制剂的分子设计、合成与作用方式[D];大连理工大学;2012年
5 吴桂叶;新苊并杂环类Mcl-1/Bcl-2蛋白双抑制剂的研究[D];大连理工大学;2011年
6 宿莉;脲基类肽氨肽酶N抑制剂的设计、合成及其抗肿瘤活性研究[D];山东大学;2011年
7 尹玲;新型肽脱甲酰基酶抑制剂的设计、合成与生物活性研究[D];山东大学;2010年
8 方勇;高通量筛选mTORC2复合体特异性小分子抑制剂[D];华中科技大学;2010年
9 张书刚;Cdks抑制剂3’单肟靛玉红对Aβ神经毒性的保护作用及其机制研究[D];南京医科大学;2009年
10 蒋忠科;微生物来源的人血管内皮生长因子受体-2酪氨酸激酶(KDR-CD)抑制剂研究[D];北京协和医学院;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 杨佳倩;5-氨基乙酰丙酸脱水酶的克隆表达与酶学性质的初步研究[D];浙江大学;2008年
2 陈华;文昌红树林微生物细胞毒活性物质的筛选[D];华南热带农业大学;2004年
3 解卉;产琼胶酶菌株Agarivorans albus QM38的发酵条件优化、酶的分离纯化及酶学性质研究[D];中国海洋大学;2009年
4 相茂功;高产普鲁兰菌株的诱变筛选及发酵条件优化[D];山东大学;2009年
5 王瑞;重组疟疾疫苗PfCP-2.9单克隆抗体的制备与特性分析[D];第二军医大学;2005年
6 段妍;产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究[D];中国海洋大学;2006年
7 杨艳华;高温α-淀粉酶产生菌的遗传改良及发酵工艺优化[D];江南大学;2009年
8 葛蔚;糊化淀粉包被脲酶抑制剂的研究[D];东北农业大学;2002年
9 王岩;人PTP1B催化结构域的克隆表达及其抑制剂的筛选[D];吉林大学;2005年
10 王树青;基于生物信息学的SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的设计[D];天津师范大学;2005年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026