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昆虫抗药性相关基因芯片的研制及其应用

丁矛  
【摘要】:随着杀虫剂在农业生产和病媒昆虫防治中的大量应用,越来越多的害虫对杀虫剂产生了抗药性。昆虫对杀虫剂抗性的发展,严重影响了农业生产和虫媒传播疾病的控制,成为害虫综合治理工作中亟待解决的问题。为了揭示害虫的抗药性机理并制定出合理的防治措施,人们对昆虫的抗性形成过程和检测技术进行了广泛的研究,并在分子水平上开展了深入的研究,揭示了昆虫对杀虫剂产生抗性的一些机理。近年来,随着基因芯片技术的发展,已经成功构建了一些昆虫抗性相关基因芯片,并应用于昆虫抗药性研究。这些芯片多是针对蝇类或蚊类昆虫构建,主要集中在昆虫细胞色素P450表达差异的研究,除此之外,尚无其它与昆虫抗性相关的基因芯片的研制报道。本研究选用了6种重要昆虫作为材料,以2761条与昆虫抗性相关的基因序列信息为基础,设计合成了58对专一和简并引物,获得了41类昆虫抗药性相关基因及一种看家基因的DNA片断,构建成含2808个靶标点的昆虫抗药性相关基因芯片,并利用该芯片对家蝇和淡色库蚊的抗性相关基因的差异表达进行了试验性研究,为揭示昆虫对杀虫剂抗性的分子机理,以及检测昆虫对杀虫剂的敏感性变化与抗性形成、发展初步建立了一种灵敏、快速的技术平台。 本研究的结果主要包括以下几个部分: 1 昆虫抗药性相关基因芯片靶标基因的获得 (1)在昆虫抗药性相关基因的选择上,依据不同基因在昆虫对杀虫剂抗性中所起的作用,共选定了41类昆虫抗药性相关基因。这些基因包括28种细胞色素P450基因,4种离子通道基因,2种保护酶基因,4种靶标位点基因,以及3种其它类型的昆虫抗性相关基因。所选基因基本上涵盖了已知的昆虫抗性相关基因类型。此外,选用β-actin基因作为基因芯片上的阳性对照,而阴性对照选用的是pUC-18质粒的部分序列。以2761条昆虫抗性相关基因序列信息为基础,总共设计了58对引物,用于扩增这些靶标基因片段,其中包括39对专一引物以及19对CODEHOP简并引物。 (2)选择了6种重要昆虫作为模板,从中扩增抗药性相关基因片段,以制备昆虫抗药性相关基因芯片。这6种昆虫分别是中华蜜蜂(Apis cerana),德国小蠊(Blattella germanica),甜菜夜蛾(Spodoptera exigua),家蝇(Musca domestica),褐飞虱(Nilaparrata lugens)以及淡色库蚊(Culex pipiens)。扩增得到目的片段克隆后,对其进行序列测定以及生物信息学分析,共有646个目的片


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