黄瓜cDNA芯片和ESTs技术平台的建立及其在逆境研究中的应用

【摘要】：环境胁迫是影响植物高产优质的一个重要因子,解析温度、光照和养分等逆境对蔬菜系统发育的影响不仅具有重要学术价值,而且对蔬菜生产具有一定的指导意义。我国园艺设施相对简陋,缺乏设施专用品种,生产上极易受到各种逆境的危害,单产只有发达国家的1/4—1/3。但植物的抗逆性涉及了多基因调控的复杂的代谢网络,近年来发展的基因芯片技术因具有微型化、集约化和标准化的优点,在拟南芥、水稻等模式植物的抗逆研究上显示出极为广阔的应用前景。为了更系统全面地研究蔬菜对生物与非生物胁迫的响应机制,本文以主要设施蔬菜黄瓜(Cucumis sativus L.)为研究对象,通过RT-PCR从黄瓜叶片中克隆黄瓜重要代谢途径中的关键酶基因,建立黄瓜cDNA芯片技术平台;并利用该自主开发的黄瓜cDNA芯片对缺镁、高温、黄瓜花叶病毒(CMV)侵染等逆境胁迫下黄瓜重要功能基因的表达和代谢途径的响应开展了研究;利用实时荧光定量技术(QRT-PCR)验证了黄瓜cDNA芯片的可靠性。另外,通过构建NaCl胁迫下的黄瓜根组织cDNA文库并进行表达序列标签(ESTs)分析,获取了一系列盐胁迫相关基因,为进一步完善黄瓜cDNA芯片奠定基础。主要取得以下结果: 1)、基因芯片技术在研究植物基因功能中发挥着越来越重要的作用,本实验通过Genbank搜索已发布的生物代谢途径中的关键酶基因序列,设计特异性的引物,采用RT-PCR法从黄瓜叶片中扩增这些酶的相应基因片段。在完成432个黄瓜基因片段的克隆分离、测序和生物信息学分析工作的基础上,对克隆PER产物的扩增和纯化方法、基因芯片片基和点样仪组合等进行了比较、分析和优化,并应用优化后的条件成功点制了国内首张黄瓜cDNA芯片。该芯片上含有9个质控cDNA片段和423个cDNA探针,涉及光反应、卡尔文循环、碳水化合物代谢、水-水循环、信号传导、激素代谢、光呼吸、防御、蛋白与氨基酸代谢等多个代谢途径。利用该芯片对黄瓜缺镁胁迫下的基因表达谱进行了初步研究,发现在缺镁胁迫下差异表达的22个基因,其中10个基因的表达受缺镁处理抑制,12个基因的表达受缺镁处理诱导,推测Rubisco大亚基和ATP合成酶CFO B亚基的下调可能是缺镁引起光合速率下降的主要原因之一。该芯片的研制为进一步高通量研究黄瓜功能基因的时空变化提供了有效的技术支撑。 2)、高温是引起农作物减产的常见原因之一。我们应用本实验制备的黄瓜cDNA芯片对黄瓜高温胁迫早期的基因表达谱进行了研究,共获得了77个差异表达显著的基因,其中42