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水稻RAD21同源基因RIX4的分子特性研究

郭小勤  
【摘要】:本论文前期工作中,通过mRNA差别显示获得了受白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv.oyzae)诱导表达的差异cDNA片段。国际互连网Blastn查询表明该基因为新基因。本课题旨在对这一与白叶枯菌抗性相关的基因进行进一步研究。 应用RT-PCR技术获得了该基因完整ORF序列,该序列全长2,187bp,编码一个728氨基酸的预测蛋白,分子量约为80.35KD,等电点为4.65。经序列拼接获得该基因的约5.3kb的基因组DNA序列,将该基因组DNA序列与eDNA序列进行比对分析,发现RIX4基因含11个外显子和10个内含子,所有10个内含子都符合保守的/GT-AG/特征。Blastp分析结果表明,RIX4蛋白在N末端含Pfam04825,在C末端含Pfam04824保守结构域,这两个保守结构域在RAD21/REC8类蛋白中很保守,表明RIX4蛋白属于RAD21/REC8类粘合蛋白。其蛋白的二级结构由21.98% a-螺旋,7.01%延伸和71.02%随意卷曲三种结构模块组成。 在不育系和保持系水稻花粉母细胞减数分裂期幼穗中得到了RIX4基因另一转录本RIX4-5片段。对RIX4基因的5个转录本进行了序列和剪接模式的分析,结果表明第6和第7外显子序列的选择性剪接模式属于常见的选择外显子上不同的5'或3'剪接位点进行选择性剪接的模式,而第6和9外显子上序列的选择性剪接模式不符合常见的7种剪接模式,是一种新的剪接模式。稻瘟病菌的侵染有利于RIX4基因前体mRNA剪接形成RIX4-1转录本,白叶枯病菌的侵染有利于RIX4基因前体mRNA剪接形成RIX4-4转录本。 运用大肠杆菌原核表达系统表达出RIX4多肽,并通过免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,以此抗体检测了植物体内RIX4蛋白的含量。在受病原菌CR3诱导的水稻IR26愈伤组织中,在诱导0~60min的水稻愈伤组织中均能检测到RIX4基因编码的全长蛋白,而且随着诱导时间的延长,检测到的蛋白量增多。在处于花粉母细胞减数分裂旺盛期的不育系和保持系的幼穗中,保持系中RIX4蛋白含量均高于不育系。在受白叶枯菌CR3侵染不同时期的IR26愈伤组织和不育系及保持系幼穗中仅能检测到RIX4基因的全长蛋白,而检测不到其它转录本所编码的蛋白。在受稻瘟菌生理小种ZB15(2001-046)诱导的近等基因系H_7R和H_7S的叶片及生理小种01-14诱导的嘉兴02-03和中早27的叶片中,RIX4蛋白含量会随着诱导时间的变化而变化,在不同的水稻品系中变化趋势不同,但在受稻瘟菌诱导的水稻叶片中均能检测到全长蛋白和RIX4-4转录本所编码的蛋白,在蛋白水平上证明了RIX4基因存在不同的转录本。 构建了RIX4基因RNA干涉表达载体,通过基因枪法对水稻粳稻品种中花11进行转化,获得9株转pCAMBIA-HANNIBAL-RIX4(461)质粒的转基因植株和12株转


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